支气管肺泡灌洗液中细胞分类及炎症因子水平与MPP合并气道黏液栓患儿预后的关联性分析

杨丽微, 仇有喜, 杨 松

肺炎支原体肺炎(Mycoplasma pneumoniae pneumonia,MPP)是儿童常见的社区获得性肺炎[1]。气道黏液栓是支气管黏膜炎症、坏死及黏液大量异常分泌,黏液积聚阻塞支气管,是导致难治性及重症MPP发生的重要因素[2]。MPP合并气道黏液栓患儿可遗留支气管扩张、肺不张及塑形性支气管炎等症状,导致患儿不良预后[3]。目前,纤维支气管镜下肺泡灌洗已成为治疗MPP合并气道黏液栓的重要介入治疗方法,有利于解除气道阻塞,减少后遗症的发生[4]。但目前影响MPP合并气道黏液栓患儿介入治疗疗效的因素尚不清楚。支气管肺泡灌洗能够获得下呼吸道和肺泡上皮表面的液体,通过检测支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中的免疫细胞及炎症细胞,有助于肺部疾病的诊断及疗效评估[5]。肺泡巨噬细胞是对呼吸道黏液阻塞后发生反应的关键防御细胞,其通过感知并响应高浓度黏液及黏液中的外源性或内源性炎症刺激,分泌白介素(interleukin,IL)-2等炎症因子,参与气道黏液的清除,与MPP的发生、发展密切相关[6]。有研究表明,MPP感染时中性粒细胞聚集和过度激活,其通过促进肺组织氧化应激损伤,加重MPP感染程度[7]。本研究通过分析MPP合并气道黏液栓患儿BALF中各细胞分类及炎症因子的表达,探讨各指标对MPP合并气道黏液栓患儿的预后评估价值。

1 资料与方法

1.1临床资料 选择2018年2月至2022年2月于佳木斯中心医院接受支气管肺泡灌洗术的168例MPP患儿的临床资料,根据支气管镜下查出气道黏液栓存在情况,将其分为MPP合并气道黏液栓组(78例)和单纯MPP组(90例)。纳入标准:(1)年龄1～14岁;(2)根据临床、影像学表现及血清肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)-IgM滴度≥1∶160和(或)MP-DNA阳性,符合《儿童社区获得性肺炎诊疗规范(2019年版)》[8]中关于MPP的诊断标准;(3)患儿入院后均经大环内酯类抗生素治疗5～7 d,临床症状、体征及影像学检查无明显改善,行纤维支气管镜检查及肺泡灌洗术治疗,符合《中国儿科可弯曲支气管镜术指南(2018年版)》[9]中关于支气管镜检查及肺泡灌洗术的适应证;(4)临床资料完整。排除标准:(1)入院前3个月内有抗生素使用史;(2)合并其他病原微生物感染,如金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌及肺结核等;(3)伴有气道狭窄、哮喘急性发作等疾病;(4)合并先天性心脏病、支气管肺发育不良及遗传代谢病等。两组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。本研究经佳木斯中心医院医学伦理委员会批准(批号:M20170034),患儿监护人知情同意。

表1 两组一般资料比较

1.2治疗方法 患儿住院后均予以吸氧、雾化吸入及阿奇霉素治疗。注射用阿奇霉素(国药集团国瑞药业有限公司),治疗剂量10 mg/(kg·d),1次/d,连续使用5～7 d。对于重症及危重症患儿,常规予以地塞米松磷酸钠注射液(郑州卓峰制药厂)1 mg/(kg·d),1次/d,连续使用5～7 d。

1.3支气管镜检查及支气管肺泡灌洗 入院后予注射用阿奇霉素治疗5～7 d,临床症状、体征及影像学检查无明显改善,择手术日清晨使用柔性视频支气管镜(BF-3C30,日本Olympus)进行支气管镜检查,术前禁饮食6 h。根据患儿年龄选择适宜的支气管镜型号,采用边麻醉边进气管的局部麻醉方法[10]。观察气管、各级支气管病变。(1)MPP合并气道黏液栓镜下表现为1个及以上肺段支气管腔内有黏稠分泌物阻塞管腔,不易吸出,部分需要借助异物钳或细胞刷清除。(2)单纯MPP镜下只表现为黏膜充血水肿、黏膜粗糙、黏膜糜烂、滤泡增生、少许分泌物。采集分泌物进行细菌培养和药敏试验。当观察到气道黏液栓阻塞时,用细胞刷将黏液栓清除,结合胸部CT或X线片,用37 ℃生理盐水对相应部位进行支气管肺段灌洗,体重≤20 kg者灌洗量为1 ml/(kg·次),>20 kg者灌洗量为2 ml/(kg·次),连续灌洗3次,负压(10 mmHg)抽吸BALF进行检测。

1.4BALF细胞分类计数方法 采用改良BALF细胞分类计数制片和瑞氏-吉姆萨染色法[11]。当支气管镜到达靶支气管后,经工作孔道注入37 ℃生理盐水,1～2 ml/(kg·次),总量≤10 ml/次,再以负压100～200 mmHg吸引获取BALF标本,灌洗液回吸收率≥40%。取BALF标本经一次性痰液过滤器过滤后,4 ℃条件下以1 500 r/min离心5 min,弃上清,用生理盐水调整细胞浓度为每低倍镜视野15～20个细胞。向细胞离心装置中加入200 μl细胞悬液,800 r/min离心4 min,玻片自然晾干30 min后采用自动化瑞氏-吉姆萨染色法染色20 min,试剂盒购自上海沪震实业公司。烘干后采用奥林巴斯CX31光学显微镜进行镜检,计数200个细胞,并进行细胞分类计数。计算巨噬细胞、中性粒细胞及淋巴细胞数目的百分比。

1.5BALF炎症因子检测 采用酶联免疫吸附试验进行检测。取BALF标本,4 ℃条件下以2 000 r/min离心10 min,取上清进行检测。实验步骤严格按照试剂盒说明书进行,应用酶标仪(美国赛默飞公司)检测各孔450 nm处的吸光度值,计算IL-2、IL-4、IL-8、IL-10浓度。所用试剂盒购自上海酶联公司。

1.6临床资料收集 通过医院电子病历系统收集研究对象的性别、年龄、体重、发热时间等一般资料。收集入院后第1天实验室检查指标,包括血红蛋白、C反应蛋白、血小板数目、外周血白细胞数目、外周血中性粒细胞百分比、外周血淋巴细胞百分比、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶水平以及血清MP-IgM抗体滴度。MP-IgM抗体滴度采用被动颗粒凝集法测定,所用试剂盒购自日本FUJIREBIO株式会社。

1.7随访 对MPP合并气道黏液栓组进行随访,于患者病程2个月时嘱其至门诊复查胸部X线片等,根据肺部炎症吸收情况,分为肺炎吸收缓慢组(35例)和肺炎完全吸收组(43例)[12]。

2 结果

2.1两组BALF中各细胞分类及炎症因子水平比较 MPP合并气道黏液栓组BALF巨噬细胞百分比、IL-4、IL-10水平低于单纯MPP组,BALF中性粒细胞百分比、IL-2、IL-8水平高于单纯MPP组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 两组BALF中各细胞分类及炎症因子水平比较

2.2MPP合并气道黏液栓组BALF巨噬细胞、中性粒细胞百分比与炎症因子水平的相关性分析结果 MPP合并气道黏液栓组BALF巨噬细胞百分比与IL-4、IL-10水平呈正相关(P<0.05),与IL-2、IL-8水平呈负相关(P<0.05);中性粒细胞百分比与IL-4、IL-10水平呈负相关(P<0.05),与IL-2、IL-8水平呈正相关(P<0.05)。见表3。

表3 MPP合并气道黏液栓组BALF巨噬细胞、中性粒细胞百分比与炎症因子水平的相关性分析结果

2.3MPP合并气道黏液栓患儿预后与临床特征的关联性分析结果 对于MPP合并气道黏液栓患儿,肺炎吸收缓慢组发热时间、BALF中性粒细胞百分比高于肺炎完全吸收组,BALF巨噬细胞百分比低于肺炎完全吸收组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 MPP合并气道黏液栓患儿预后与临床特征的关联性分析结果

2.4影响MPP合并气道黏液栓患儿肺炎吸收缓慢的多因素logistic回归分析结果 以MPP合并气道黏液栓患儿病程2个月时肺炎吸收情况(肺炎吸收缓慢=1,肺炎完全吸收=0)为因变量,以发热时间、BALF巨噬细胞百分比、BALF中性粒细胞百分比为自变量纳入多因素logistic回归。分析结果显示,较长的发热时间、较高的BALF中性粒细胞百分比是促进MPP合并气道黏液栓患儿肺炎吸收缓慢的独立危险因素(P<0.05);较高的BALF巨噬细胞百分比是抑制肺炎吸收缓慢的保护因素(P<0.05)。见表5。

表5 影响MPP合并气道黏液栓患儿肺炎吸收缓慢的多因素logistic回归分析结果

2.5发热时间、BALF巨噬细胞及中性粒细胞百分比预测MPP合并气道黏液栓患儿肺炎吸收缓慢的效能分析结果 ROC曲线分析结果显示,发热时间、BALF巨噬细胞百分比、BALF中性粒细胞百分比均可有效预测MPP合并气道黏液栓患儿肺炎吸收缓慢的发生情况(P<0.05),且三指标联合可进一步提高预测效能,灵敏度和特异度分别为89.00%、75.00%。见表6,图1。

图1 发热时间、BALF巨噬细胞及中性粒细胞百分比预测MPP合并气道黏液栓患儿肺炎吸收缓慢的ROC曲线图

表6 发热时间、BALF巨噬细胞及中性粒细胞百分比预测MPP合并气道黏液栓患儿肺炎吸收缓慢的ROC曲线分析结果

3 讨论

3.1气道黏液栓是支气管黏膜炎症、坏死及黏液分泌异常、黏液排除障碍引起气道内积聚,结块形成,其主要成分为黏液、巨噬细胞及中性粒细胞等。气道黏液栓若清除不及时,梗阻长期存在,管壁压力升高扩张,可导致支气管扩张、肺不张及闭塞性支气管炎,严重时可危及患者生命。支气管镜检查及肺泡灌洗术对于清除气道黏液栓及继发性病变如阻塞性肺炎有较好的临床效果。但MPP合并气道黏液栓患儿支气管镜灌洗术后何时完全吸收及影响MPP合并气道黏液栓患儿预后的因素尚不清楚。因此有必要深入研究MPP合并气道黏液栓疾病机制,寻找能够评估预后的生物标志物,指导临床诊治。正常肺泡上皮细胞表面有一层肺上皮黏液层,具有维持肺泡表面张力及稳定性的作用。对BALF中各细胞分类及炎症因子进行测定分析,可能有助于MPP合并气道黏液栓患儿的预后评估。

3.2肺泡巨噬细胞存在于肺上皮黏液层中,具有丰富的溶酶体及吞噬体,能吞噬清除细菌、灰尘等颗粒,活化淋巴细胞,是机体防御功能的第一道防线。在肺部支原体、细菌等微生物感染时,细菌代谢产物能够激活肺泡巨噬细胞,分泌大量炎症因子,巨噬细胞形成伪足,包裹致病菌形成吞噬体,在与溶酶体结合后,释放消化致病菌的氧化酶和水解酶,杀死病原菌[13]。本研究中,MPP合并气道黏液栓患儿BALF巨噬细胞百分比显著减少,IL-4、IL-10水平降低,而IL-2、IL-8水平升高,表明巨噬细胞减少及炎症因子平衡紊乱参与促进MPP合并气道黏液栓的疾病发生。有学者通过上皮钠通道β亚基SCNN1B转基因小鼠构建气道黏液栓模型,发现模型小鼠气道表面液体脱水,上皮细胞大量分泌黏蛋白,巨噬细胞大量凋亡、数目减少,气道中性粒细胞增多,促进肺部炎症的发展,气道大量黏液栓形成[5]。笔者分析认为,BALF巨噬细胞百分比减少的原因与Th1/Th2型细胞因子平衡失调有关。MPP感染时由于支原体负荷较高,导致肺泡局部中性粒细胞、嗜酸性粒细胞浸润增加,促进大量炎症因子,如IL-5分泌,其能够诱导肺泡上皮细胞分泌产生Th2型细胞因子,如IL-4、IL-10等,诱导巨噬细胞凋亡,导致BALF中巨噬细胞百分比减少[14]。

3.3本研究中,MPP合并气道黏液栓患儿BALF中性粒细胞百分比显著增加,与BALF中炎症因子表达有关,提示中性粒细胞可能参与促进MPP患儿气道黏液栓的形成。研究表明,MPP感染时,气道黏膜上皮细胞能够分泌产生粒细胞/单核细胞集落刺激因子,促进大量中性粒细胞募集和活化,导致BALF中性粒细胞百分比增加[15]。此外,MPP患儿中性粒细胞募集活化后能够促进髓过氧化物酶分泌,引起肺组织细胞氧化应激的发生,加重肺组织炎症及肺组织损伤,组织坏死脱落造成气道黏液栓形成[15]。本研究中,肺炎吸收缓慢组MPP合并气道黏液栓患儿BALF中性粒细胞百分比升高。有研究发现,MPP中大量中性粒细胞激活,导致Th17细胞活化,分泌IL-17、IL-6、IL-8等促炎因子,降低巨噬细胞的黏液及微生物清除能力,加重肺部炎症,导致黏液吸收缓慢[16]。这与本研究中MPP合并气道黏液栓患儿BALF中性粒细胞百分比与IL-2、IL-8水平呈正相关的结果一致。因此,BALF中性粒细胞百分比升高可能参与了MPP患儿气道黏液栓的形成,是评估患者预后的标志物。

3.4MPP合并气道黏液栓患儿临床表现轻重不一,肺部炎症吸收的时间也不同。本研究以病程2个月为预后评估的时间点,结果78例MPP合并气道黏液栓患儿中,肺炎吸收缓慢患儿有35例,占44.87%,与既往研究报道结果相似[17]。本研究中,较长的发热时间是影响MPP合并气道黏液栓患儿肺炎吸收缓慢的独立危险因素。笔者分析,MP本身作为致热源能够诱导IL-2、IL-8等促炎因子的产生,使得肺组织损伤加重、肺组织坏死,导致肺炎吸收缓慢[18]。本研究中,BALF巨噬细胞百分比降低,中性粒细胞百分比升高是影响MPP合并气道黏液栓患儿肺炎吸收缓慢的独立危险因素。有学者在气道黏液栓小鼠模型中发现,肺泡巨噬细胞中转录因子,如干扰素调控因子1过度表达能够抑制单核巨噬细胞增殖,促进大量中性粒细胞浸润、活化,加重脂多糖等因素诱导的肺组织损伤及肺炎疾病进展,导致疾病恢复缓慢[19]。此外,BALF巨噬细胞百分比及巨噬细胞活性下降可导致CD4+/CD8+T淋巴细胞比值降低,机体细胞免疫功能紊乱,抗感染免疫能力降低,导致MP不能被快速清除,大量中性粒细胞渗透至细支气管及血管周围,加重肺部组织炎症,导致患儿即使经积极治疗后病情仍加重或迁延不愈[20]。ROC曲线分析结果显示,发热时间、BALF巨噬细胞百分比、BALF中性粒细胞百分比三指标联合对MPP合并气道黏液栓患儿肺炎吸收缓慢具有较高的预测价值,其灵敏度和特异度分别为89.00%、75.00%,优于单一指标。因此,临床医师可参考该模型对MPP合并气道黏液栓患儿的临床预后进行评估,以制定个体化的治疗措施,改善患儿预后。

综上所述,MPP合并气道黏液栓患儿BALF巨噬细胞百分比降低,中性粒细胞百分比升高,两者与BALF中炎症因子水平有关,均参与疾病的发生、发展。发热时间、BALF巨噬细胞百分比、中性粒细胞百分比三指标联合对MPP合并气道黏液栓患儿肺炎吸收缓慢具有较好的预测价值,有利于临床医师对患儿预后进行评估,指导临床治疗。但本研究也存在一定的不足,由于BALF中存在复杂的细胞成分,不同类型免疫细胞及同一种免疫细胞不同亚型也可能发挥相应的生物学功能,而且BALF中还存在其他细胞因子,如IL-17、IL-6等,其在疾病发生、发展中的作用有待进一步深入研究。