响应面法优化黑果腺肋花楸酒酿造工艺及成分研究

杨 晶，高晓晨，孙 尧，李 航，杨佳圆，徐 祎，高 冷*

(1.长春工业大学化学与生命科学学院，吉林长春 130012；2.长春中医药大学吉林省人参科学研究院，吉林长春 130117)

黑果腺肋花楸(Aronia melanocarpa)又名黑果花楸，也称野樱莓、不老莓，蔷薇科腺肋花楸属植物，原产于北美、欧洲等地，20 世纪90 年代引种至我国，现东北地区有全国最大的黑果花楸种植基地，是集药用、食用及生态价值一体的珍贵经济树种[1]。黑果腺肋花楸果实中富含脂肪、蛋白质、有机酸、碳水化合物、多种维生素和矿物类元素、糖类等丰富营养物质[2]，同时含有大量的多酚类化合物[3]，如花青素[4]、类黄酮等，具有较强的抗氧化[5]、防衰老等功效，同时具有抗炎抑菌[6]、降血糖[7]、降压[8]、抗癌和抗抑郁等功效。

黑果花楸进行酒精发酵是提高其利用价值的方式之一。果酒是以新鲜水果或果汁为原料，经过发酵调配制作而成的饮用酒。果酒在制备过程中保留了原有的风味物质，富含有机酸[9]、氨基酸[10]、维生素[11]、矿物元素以及多酚[12]类营养成分，具有抗氧化[13]、抗衰老[14]等调节功能，日益受到消费者的关注和欢迎。

通过发酵，创造一个更利于黑果花楸功能性成分富集和保护的环境，使其充分发挥功效和作用。在单因素实验基础上，利用响应面法优化黑果花楸酒的发酵工艺；利用HPLC-MS/MS 对黑果花楸酒多酚类物质进行成分分析；利用气相色谱对黑果花楸酒香气成分进行鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

黑果花楸：长春金荷药业有限公司；AB-8大孔树脂：天津南开大学化工厂；果酒酵母：安琪酵母有限公司；白糖：市售。

试剂及耗材：亚硫酸钠、碳酸钠，江西博浩源化工有限公司；无水乙醇(分析纯)、甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)、甲酸(色谱纯)等，哈尔滨盛达生化仪器有限公司；没食子酸标准品、矢车菊-3-葡萄糖苷、矢车菊-3-阿拉伯糖苷、矢车菊-3-半乳糖苷、矢车菊-3-木糖苷标准品，青岛捷世康生物技术有限公司；福林酚试剂(分析纯)，上海源叶生物科技有限公司。

仪器设备：PHS-3C 型pH 计，济南鑫露生物技术有限公司；TU-1800PC 型紫外可见分光光度计，上海双旭电子有限公司；DZF-6050 型真空干燥箱，北京海富达科技有限公司；MJ-BL25C3 搅拌机，广东美的电器制造公司；HX2002T 型电子天平，慈溪市天东衡器厂；LC2040/MS-8045 型HPLC-MS/MS、7890B 气相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 检测方法

总酸：电位滴定法；总糖：斐林试剂法；总酚：Folin-酚试剂法[15]；酒精度：参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

1.2.2 生产工艺

黑果腺肋花楸果→挑选→清洗→沥干→破碎打浆→加入果胶酶→加入亚硫酸钠→糖→酵母→发酵→过滤→陈酿→过滤→调整成分→过滤→成品

1.2.3 操作要点

破碎打浆：挑选较为饱满的黑果花楸果实破碎打浆。

酶解：按30 mg/L 加入果胶酶，在35 ℃下酶解2 h，使果浆更具流动性，使果汁澄清。

抑菌：向果浆中加入亚硫酸钠，搅拌均匀，抑制杂菌生长。

糖度调整：加入适量白砂糖，调整发酵液初始糖度。

发酵：接种果酒酵母，恒温发酵，发酵中期间接性搅拌，发酵4～9 d，每24 h 测定酒精度及糖度，当二者不再发生变化时，判定发酵结束。

陈酿：过滤处理，恒温避光环境下贮藏。

1.2.4 单因素试验

黑果花楸果浆总糖含量为7%，分别考察发酵液含糖量12 %、14 %、16 %、18 %、20 %、22 %，接种0.7 g/L 酵母，发酵温度26 ℃，发酵7 d；发酵温度20 ℃、23 ℃、26 ℃、29 ℃、32 ℃、35 ℃，接种0.7 g/L酵母，发酵液含糖量18 %，发酵7 d；发酵时间4 d、5 d、6 d、7 d、8 d、9 d，接种0.7 g/L 酵母，发酵液含糖量18%，发酵温度26 ℃；酵母接种量0.4 g/L、0.5 g/L、0.6 g/L、0.7 g/L、0.8 g/L、0.9 g/L，发酵液含糖量18%，发酵温度26 ℃，发酵7 d。以果酒酒精度、感官评价分值为评价指标，确定各因素的最佳条件。

1.2.5 响应面法优化黑果腺肋花楸酒的发酵工艺

根据单因素试验，以发酵液含糖量(A)、发酵温度(B)、发酵时间(C)及酵母接种量(D)为自变量，以酒精度(Y)为响应值，每个因素取三个水平，进行Box-Behnken 响应面优化黑果腺肋花楸酒发酵最佳工艺。选择的因素水平如表1所示。

表1 响应面优化分析因素表格

1.2.6 感官评价

参考葡萄酒感官评分[16]，选择10人组建感官评定小组，依据感官评分标准对黑果腺肋花楸酒进行感官评定，取其平均值作为最终评分结果。感官评分标准如表2所示。

表2 黑果腺肋花楸酒感官评定

1.2.7 黑果花楸多酚类化合物的含量测定方法

根据李斌[17]的方法，用AB-8 大孔吸附树脂纯化黑果花楸中的多酚物质。以没食子酸为对照品，取没食子酸标准品配置成1 mg/mL 的标准溶液，采用福林酚试剂与碳酸钠试剂显色法[17]，在765 nm波长下测定吸光度，回归方程为y=0.1314x-0.0567，R2=0.9985。

式中：C 为待测液浓度，N 为稀释倍数，V 为待测液体积，m为黑果花楸质量。

1.2.8 黑果花楸酒成分分析

高效液相色谱条件参考刘宪军实验条件[18]：色谱柱为C18色谱柱；流动相A 为乙腈；流动相B 为0.2%甲酸水溶液；流速1 mL/min，柱温箱30 ℃，进样量为10 μL，设置检测波长为520 nm。

质谱条件[19]：正离子模式，全自动二级质谱扫描，扫描范围m/z 50～1000；干燥气压力207 kPa；流速12 L/min；温度350 ℃，毛细管电压3500 V。

1.2.9 黑果花楸酒香气成分鉴定

气相色谱条件：色谱柱TR-5MS(30 m×0.25 mm,0.25 μm)，进样口温度为250 ℃，载气为氦气，恒定流速为1 mL/min，升温程序：起始温度25 ℃，以5 ℃/min 升至120 ℃，保持5 min，以10 ℃/min 升至220 ℃保持5 min，进样模式为不分流。

表3 梯度洗脱时间表

1.2.10 数据统计分析

进行3 组平行实验，实验设计与统计分析采用Design-Expert 8.0软件、Origin 9.0软件等。

2 结果与分析

2.1 黑果花楸酒单因素试验

2.1.1 发酵液含糖量对黑果腺肋花楸酒发酵的影响

由图1 可知，当发酵液含糖量较低时，产生的酒精量较少，随着发酵液含糖量的增加，酒精度逐渐达到最佳值；当发酵液含糖量超过18%时，酒精度开始呈下降趋势，由于糖含量过高，发酵液的渗透压增大，对酵母产生了抑制作用[20]。酒精度在16%vol～20%vol 变化不大，且此时感官评价分值最高，因此，确定最佳发酵液含糖量为18%。

图1 发酵液含糖量对黑果花楸酒酒精度的影响

2.1.2 发酵温度对黑果腺肋花楸酒发酵的影响

由图2 可知，温度对发酵有较大影响，酵母菌在低温环境下发酵能力较弱，当发酵温度低于20 ℃时，产生的酒精量较少；随着发酵温度的增加，酒精度逐渐达到最佳值；当发酵温度超过26 ℃时，对发酵产生抑制作用，酒精度开始呈下降趋势。酒精度在23～29 ℃时变化不大，且此时感官评价分值最高，因此，确定最佳发酵温度为26 ℃。

图2 发酵温度对黑果花楸酒酒精度的影响

2.1.3 发酵时间对黑果腺肋花楸酒发酵的影响

由图3 可知，随着发酵时间延长，酒精度逐渐增加，当发酵时间小于7 d时，果酒随着发酵时间延长，感官评价逐渐上升，当发酵时间等于7 d 时，酒精度达到最大，香气和谐，感官评价最佳，发酵时间继续延长，酒精度逐渐降低。酒精度在发酵时间6～8 d 变化不大，且此时感官评价分值最高，因此，确定最佳发酵时间7 d。

图3 发酵时间对黑果花楸酒酒精度的影响

2.1.4 酵母接种量对黑果腺肋花楸酒发酵的影响

由图4 可知，当酵母接种量较低时，代谢繁殖速度缓慢，产生的酒精量较少，随着酵母接种量的增加，当酵母接种量为0.7 g/L 时，酒精度达到最佳值，继续添加酵母，酒精度开始呈下降趋势，感官评价明显降低，可能是因为过多的糖导致酵母自溶，不利于发酵。酒精度在酵母添加量0.6～0.8 g/L 变化不大，且此时感官评价分值最高，因此，确定最佳酵母接种量0.7 g/L。

图4 酵母接种量对黑果花楸酒酒精度的影响

2.2 响应面优化黑果腺肋花楸果酒的发酵工艺

2.2.1 响应面优化结果

依据单因素试验结果，利用Design Expert 软件，采用Box-Behnken Design 建立数学模型，以发酵液含糖量(A)、发酵温度(B)、发酵时间(C)、酵母接种量(D)为自变量，酒精度(Y)为响应值，进行四因素三水平响应面试验设计。响应面设计及结果见表4。

表4 响应面优化果酒发酵工艺试验结果

2.2.2 回归方程与方差分析

由表5 所示，该模型P＜0.0001，极显著，且失拟项P=0.5592＞0.05 不显著。模型的决定系数R2=0.9788，校正系数R2Adj=0.9576，说明回归模型拟合状况良好，不存在失拟因素，可以利用此模型对黑果腺肋花楸果酒发酵过程中酒精度的变化进行分析和预测。根据F 值可知，各因素对酒精度的影响顺序(从大到小)为：发酵液含糖量(A)＞发酵温度(B)＞酵母接种量(D)＞发酵时间(C)。

表5 回归模型方差分析

2.2.3 响应面交互作用分析

由图5 可知，发酵液含糖量(A)、发酵温度(B)、发酵时间(C)及酵母接种量(D)之间交互变化时，果酒的酒精度呈现相应的变化。根据等高线可知交互效应的大小，椭圆形表示交互作用显著，圆形表示交互作用不显著，因此可知加糖量和发酵温度对果酒影响最大，发酵时间及酵母接种量次之。通过Design-Expert 8.0 软件预测得到的最佳生产方案为：发酵液含糖量17.29%、发酵温度25.53 ℃、发酵时间6.97 d、酵母接种量0.784 g/L。实际操作选取发酵液含糖量17 %、发酵温度25.5 ℃、发酵时间7 d、酵母接种量0.8 g/L。进行三次实验，果酒平均酒精度为8.5%vol。

2.3 感官指标

2.3.1 感官品评

在最佳条件下制得的黑果花楸酒呈红宝石色，澄清透明，口感醇厚，果香味与酒香味协调，感官评价达85分。

2.3.2 理化指标

酒精度为8.5%vol，多酚类物质含量为3.580mg/mL，总糖含量为14.45 g/L。

2.4 黑果花楸酒多酚类物质的成分分析

通过HPLC-MS/MS 对黑果花楸酒多酚类物质的成分进行分析(总离子流图见图6)，根据各个化合物的出峰时间及离子碎片查阅参考文献可知，黑果花楸多酚类物质中有矢车菊-3-O-半乳糖苷[21]、矢车菊-3-O-葡萄糖苷[22]、矢车菊-3-O-阿拉伯糖苷[23]、矢车菊-3-O-木糖苷[24]、槲皮素-3-O-芸香糖苷[25]、金丝桃苷[26]、槲皮素-3-O-葡萄糖苷[27]，其中矢车菊-3-O-半乳糖苷含量最高。

图6 黑果花楸酒多酚类物质总离子流图

如表6 所示，通过化合物的保留时间及化合物的特征碎裂方式共计找到7 个化合物，矢车菊素主要有矢车菊-3-O-半乳糖苷、矢车菊-3-O-葡萄糖苷、矢车菊-3-O-阿拉伯糖苷、矢车菊-3-O-木糖苷，其中矢车菊-3-O-半乳糖苷含量最高，化合物存在主要离子峰m/z 287。M/z 287 是由矢车菊-3-O-半乳糖苷、矢车菊-3-O-葡萄糖苷失去一分子葡萄糖苷形成的，矢车菊-3-O-阿拉伯糖苷(m/z 419)失去一分子阿拉伯糖苷形成的，矢车菊-3-O-木糖苷(m/z 419)失去一分子木糖苷形成的。从上述图表中，可以得出，矢车菊素的碎裂方式主要是去葡萄糖醛酸，这与报道过的多酚类化合物裂解方式一致[21-24]。

表6 黑果花楸酒多酚类物质成分组成

2.5 黑果花楸酒易挥发成分分析

图7 标准品香气成分色谱图

由表7 可知，黑果花楸酒中检测出12 种挥发性香气物质，含量较高的香气物质有乙酸乙酯、异戊醇、苯甲醇、辛酸乙酯、棕榈酸乙酯、异丁醇等。

表7 黑果花楸酒香气成分组成

3 结论

黑果腺肋花楸酒最优工艺条件为发酵液含糖量17 %、发酵温度25.5 ℃、发酵时间7 d 以及酵母接种量0.8 g/L，此时酒精度为8.5 %vol，多酚类物质含量为3.580 mg/mL。MS/MS 结果显示黑果腺肋花楸中多酚类物质主要有有矢车菊-3-O-半乳糖苷、矢车菊-3-O-葡萄糖苷、矢车菊-3-O-阿拉伯糖苷、矢车菊-3-O-木糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖苷、金丝桃苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷，其中矢车菊-3-O-半乳糖苷含量最高，为后续功能性研究提供基础。气相色谱结果表明，该果酒主要包含12种香气成分，主要是乙酸乙酯、乙酸异戊酯、异戊醇、苯甲醇、乙酸、辛酸乙酯、棕榈酸乙酯、异丁醇等。该果酒香气成分丰富，感官评价极佳。该工艺为黑果花楸产品生加工利用提供了一个途径，为农民提供了增产增收的条件。

图8 黑果花楸酒香气成分色谱图