基于网络药理学和分子对接探究枸杞子治疗膝骨关节炎的潜在作用机制

刘艳霞，徐创龙，原淳淳，索文栋，杨景科，唐德志，徐浩

1.宁夏回族自治区中医医院暨中医研究院，宁夏 银川 750021；2.上海中医药大学附属龙华医院，上海 200030

膝骨关节炎(knee osteoarthritis，KOA)是以关节软骨退变、骨质增生、软骨下骨病变、滑膜炎症等病理改变的一种慢性退行性关节疾病[1-2]，可引起疼痛、关节活动受限，严重时可致膝内翻或膝外翻畸形，从而降低患者生活质量。由于膝关节解剖结构和功能结构的特殊性，KOA在全世界291种致残疾病中排名第11位[3]。目前KOA的发病机制不清楚，临床主要治疗方法为口服药物治疗。长期口服非甾体类药物等对人体具有较大的副作用，如引起消化性溃疡等，而中药在治疗本病时具有简、效、廉等特点，且历史悠久，经验丰富，能更好地改善KOA 患者症状[4]，从而明显提高患者的生活质量。在中医理论中，KOA 多归属“膝痛”“骨痹”等范畴，《黄帝内经》指出“痛在骨，骨重不可举，骨髓酸痛……名曰骨痹”，骨痹发生于筋骨关节，发病的主要病机是“肾气衰弱，寒湿入骨”，根据“肾主骨”“肝主筋”“脾主肌肉”的理论，确立了从肝肾脾论治骨痹的治则。有研究发现在治疗“骨痹”的用药规律中[5-6]，以肝肾亏虚为“骨痹”的发病根本，从“虚而补之”为根本治则，多选用归肝、肾、脾经的药物。

枸杞子(Lycii Fructus)为常用中药材之一，用药历史悠久，其为茄科植物宁夏枸杞Lycium barbarumL.的干燥成熟果实。在《2020中国药典》中记载，枸杞子归肝、肾经，具有滋补肝肾、益精明目等功效。研究显示枸杞子中含有多糖、黄酮类、萜类、生物碱等多种生物活性成分，具有抗氧化、调节免疫、抗炎、抗衰老、抗肿瘤、改善骨质疏松等药理活性[7]，是珍贵的药食两用植物资源。因此本研究通过构建“药物-成分-靶点-通路-疾病”网络，从而预测枸杞子治疗KOA的有效成分及其作用机制，为后续研究枸杞子活性成分的作用于KOA的作用机制以及治疗KOA的药物的研发提供参照。

1 材料与方法

1.1 枸杞子药物有效成分及靶点的获取 通过在中药系统药理学数据库与分析平台2.3(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%且类药性指数(drug likeness，DL)≥0.18 获取枸杞子有效活性成分及各成分对应的体内作用靶点蛋白，将靶点蛋白输入Uniprot 蛋白质数据库中(数据收集截止日期2022-08)，筛选条件为“Reviewed”，限定物种为“Human(人)”，合并后删除重复基因，保留唯一值，最终得到枸杞子活性成分的候选靶标对应的基因名。

1.2 枸杞子-活性成分-作用靶点网络构建 将1.1 收集到的将枸杞子活性成分及其体内作用的靶点导入Cytoscape 3.9.1软件，构建“枸杞子-活性成分-靶点”网络图。

1.3 枸杞子治疗膝骨关节炎预测靶点的筛选 以“knee osteoarthritis”OR“KOA”作为检索词，分别利用Gene Cards 数据库(http://www.genecard.org)和OMIM数据库(https://www.omim.org/)来获取膝骨关节炎的疾病相关基因，根据score 筛选KOA 相关靶点。将疾病靶点与药物靶点导入微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)数据分析平台绘制Venny图，确定枸杞子治疗KOA的作用靶点。

1.4 枸杞子治疗膝骨关节炎靶点网络的构建 将“1.1”项下获得的枸杞子活性成分与1.3中枸杞子治疗KOA 作用的潜在靶点导入生物信息分析软件Cytoscape 3.9.1，构建“枸杞子-主要活性成分-疾病靶点”网络图。

1.5 蛋白相互作用(PPI)网络构建及核心靶点筛选 将1.3 项下所获共同靶点上传至String (https://string-db.org/)平台构建枸杞子治疗KOA 的PPI 网络。将所获相关tsv 格式数据导入Cytoscape 3.9.1 软件进行拓扑属性分析，构建“枸杞子治疗KOA核心靶点”关系网络图。

1.6 分子对接预测活性成分与膝骨关节炎的核心靶点基因结合活性 在Cytospace 3.9.2 中构建“药物-疾病-靶点”的作用网络，将枸杞子发挥治疗KOA的关键靶点及活性成分进行分子对接实验，验证其相互作用活性。根据Degree值由高到低进行排序，然后利用TCMSP数据库下载的枸杞子发挥治疗KOA主要的3 个活性成分三维分子结构，通过PCSB PDB 数据库(https//www.rcsb.org/)下载枸杞子发挥治疗KOA 的关键靶点蛋白分子下载，并根据分子对接蛋白结构六大原则进行筛选，最终获取可靠性最高的蛋白结构并下载PDB Format 格式，利用StoneMIND Collector 软件进行结构识别和修饰，利用Discovery Studio Client 2019进行生物学验证对接。

1.7 核心靶点GO 富集分析及KEGG 信号通路富集分析与可视化 利用生物学信息注释数据库6.8(the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，DAVID，https://david.ncifcrf.gov/)对枸杞子潜在治疗KOA 靶点进行GO (Gene Ontology)及KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信号通路富集分析，筛选前五个具有显著性差异的GO和KEGG数据予可视化处理。

2 结果

2.1 枸杞子有效活性成分筛选结果 通过检索和筛选后共获取枸杞子有效活性成分共36 个(表1)。通过Uniprot数据库，将有效成分的靶标名称转换为人源基因并删除重复基因后获得203 潜在作用靶点，即得枸杞子活性成分体内作用靶点。

表1 枸杞子有效活性成分Table 1 Effective active ingredients of Lycii Fructus

2.2 枸杞子-活性成分-作用靶点网络构建 收集到的枸杞子活性成分体内作用靶标导入Cytoscape 3.9.1 软件，构建“枸杞子-活性成分-靶点”网络图(图1)。该网络共包括240个节点，其中中心的黄色节点代表枸杞子，36 个橙色节点代表枸杞子的活性成分，203 个绿色节点代表枸杞子活性成分体内发挥作用的相关靶点，394 条边代表枸杞子活性成分与相关的靶点的相互作用。其中槲皮素的节点值最大(Degree值为152)，说明其可能是枸杞子在体内发挥疾病治疗作用的关键有效成分。

图1 枸杞子-活性成分－靶点网络图Figure 1 Lycii Fructus-active ingredients-targets network diagram

2.3 枸杞子有效活性成分治疗膝骨关节炎作用靶点预测及筛选 通过Gene Cards 平台与OMIM 数据库共获取KOA 疾病相关靶点基因有2 303 个，以Relevance score≥2.687作为筛选条件后，获得577个靶点基因。然后将枸杞子主要活性作用靶点与KOA 疾病靶点进行映射后获得66靶点基因，即为枸杞子治疗KOA的潜在作用靶点，见图2。

图2 枸杞子主要活性成分靶点与膝骨关节炎靶点Venn图Figure 2 Venn diagram of the target of main active ingredient of Lycii Fructus and target of knee osteoarthritis

2.4 枸杞子药物-活性成分-膝骨关节炎靶点网络图构建 将“2.3 中得到的共同靶点对应上活性成分，制Excel表格，将该表导入Cytoscape3.9.2中，绘制得到枸杞子药物-活性成分-疾病靶点网络图(图3)，该网共有79个节点，其中黄色节点代表枸杞子，12个橙色节点代表枸杞子的有效活性成分(36个有效成分中有24个无治疗KOA的作用)，66个蓝色节点代表枸杞子有效成分治疗KOA关键靶点，102条边代表枸杞子活性成分与疾病之间的相互作用。度值越高，则节点颜色越深，靶点越重要，其中槲皮素(quercetin)的节点值最大(Degree=60)，其次为β-谷甾醇、黄豆黄素(Degree 值均为11)，其中槲皮素作用于59个疾病靶点，主要作用于PTGS2、PTGS1、PLAU、PIK3CG、BCL2、BAX、JUN、CASP3、TGFB1、PON1、AR、PPARG 等(列举Degree≥2)，说明槲皮素在枸杞子治疗KOA中起关键作用。

图3 枸杞子药物-活性成分-膝骨关节炎靶点网络图Figure 3 Network diagram of Lycii Fructus-active ingredients-tar gets for knee osteoarthritis

2.5 枸杞子治疗膝骨性关节炎作用靶点PPI网络及核心靶点 将枸杞子治疗KOA疾病潜在66个靶点输入String平台，构建枸杞子治疗KOA靶点相互作用网络(PPI)，PPI网络(图4)中包含66 个节点和272 个相互作用(连线)。网络平均度值为33.4，平均聚集系数为0.784，P值：＜1.0e-16。将获得的相关tsv 格式数据导入Cytoscape3.9.2软件进行网络拓扑分析，如图5所示，圆形图标则代表核心靶点。这些靶点中度值越高，则节点颜色越深，靶点越重要，度值排名靠前的靶点(列举前10 个核心靶点，见表2)有肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-6(IL-6)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、细胞肿瘤抗原p53 (TP53)、基质金属蛋白酶9 (MMP9)、重组人胱天蛋白酶3(CASP3)、前列素G/H合成酶2(PTGS2)、c-Jun氨基端激酶(JUN)、表皮生长因子(EGF)等，这10个关键靶点可能通过降低炎症因子表达水平及调控骨细胞合成代谢的生物过程等在枸杞子治疗KOA 作用机制中发挥关键作用。

图4 枸杞子治疗膝骨关节炎的PPI网络图Figure 4 PPI network diagram of Lycii Fructus in the treatment of knee osteoarthritis

表2 核心靶点的拓扑学参数信息Table 2 Topological parameter information of the core target

2.6 分子对接预测活性成分与膝骨关节炎的核心靶点基因结合活性 对图3所示网络图进行分析，得到枸杞子治疗KOA 主要活性成分(槲皮素、β-谷甾醇、黄豆黄素)，将这些成分与网络中度值较高的核心靶点PTGS2、PTGS1、OPRM1进行分子对接分析(表3、图6)。枸杞子主要活性成分与活性位点关键氨基酸残基形成极性或非极性键，以稳定配体和受体的结合。枸杞子主要活性成分相互作用力分析结果显示，主要活性成分通过范德华力、氢键、Pi 相互作用与关键靶点的活性位点相结合。

图6 分子对接模式图Figure 6 Molecular docking

表3 枸杞子治疗膝骨关节炎主要活性成分及作用靶点Table 3 Main active ingredients and targets of Lycii Fructus in the treatment of knee osteoarthritis

2.7 枸杞子治疗膝骨关节炎关键靶点基因GO和KEGG富集分析 利用DAVID数据库对筛选所获66个枸杞子治疗KOA关键靶点基因进行GO-BP、GO-CC、GO-MF和KEGG富集分析。GO-BP、GO-CC、GO-MF分析均以P＜0.01条件进行筛选，按P值从小到大排序取前5条通路进行分析。生物过程(BP)分析中主要涉及基因表达的正向调控(positive regulation of gene expression)、炎症反应(inflammatory respons)、药物反应(response to drug)、细胞对脂多糖的反应(cellular response to lipopolysaccharide)等。细胞组分(CC)涉及细胞外空隙(extracellular space)、细胞外区域(extracellular region)、内质网(endoplasmic reticulum lumen)、细胞外基质(extracellular matrix)等。分子功能(MF)分析中主要涉及酶结合(enzyme binding)、丝氨酸蛋白酶肽链内切酶活性(serine-type endopeptidase activity)、相同的蛋白结合(identical protein binding)、细胞因子活性(cytokine activity)等(图7)，由此推测出枸杞子的活性成分可能通过干预以上生物过程发挥治疗KOA 的作用。KEGG富集的通路结果(图8)显示，枸杞子主要通过晚期糖基化终末产物-糖基化终末产物受体信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complication)、癌症信号通路(pathways in cancer)、IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway)、脂质和动脉粥样硬化通路(lipid and atherosclerosis)、肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)等信号通路发挥治疗KOA 的作用。

图7 枸杞子治疗膝骨关节炎靶点GO分析Figure 7 GO analysis of target of Lycii Fructus in the treatment of knee osteoarthritis

图8 枸杞子治疗膝骨关节炎的靶点KEGG分析Figure 8 KEGG analysis of target of Lycii Fructus in the treatment of knee osteoarthritis

3 讨论

本研究发现，枸杞子发挥治疗KOA主要活性成分是槲皮素。有研究发现槲皮素可促进脂多糖诱导的软骨细胞增殖，调控软骨细胞外基质合成与代谢平衡，抑制炎症反应，恢复软骨细胞功能[8-11]。此外研究表明，局部炎症因子释放相关及软骨细胞不能维持细胞外基质和软骨下骨合成和降解之间的稳态，导致KOA 发生[12]。因此，枸杞子中发挥治疗KOA 最主要活性成分为槲皮素，可能与调控软骨细胞的代谢平衡、降低氧化应激反应、改善内环境的炎症反应等机制密切相关。

本研究枸杞子药物-活性成分-疾病靶点网络图和PPI结果表明，枸杞子中多种有效成分作用于TNF、IL6、AKT-1 关键靶点基因。TNF 和IL-6 是一种具有多功能的细胞因子，且参与炎性反应调节。研究发现TNF能促进胶原酶和前列腺素E2的产生及IL-6的分泌，可使软骨及软骨下骨结构改变、刺激软骨细胞增殖，导致关节肿胀以及软骨侵蚀等炎症反应，加重KOA患者的临床表现[13-16]。也有研究表明KOA患者关节损伤程度与血清中TNF-α、IL-6 水平显著相关[17]。AKT1 参与调节新陈代谢、增殖、细胞存活、生长和血管生成等过程[18]，研究发现AKT1 参与软骨内骨化过程，抑制骨赘的形成，还可以通过磷酸化使蛋白聚糖的合成增多，促进了人关节软骨细胞的细胞活力[19-20]。因此可以推测枸杞子各成分主要作用于炎性反应调节、调控软骨细胞的增殖、分化等相关的靶点发挥治疗KOA。利用DAVID数据库对枸杞子治疗KOA关键靶标进行GO富集分析，研究显示这些靶点与PPI网络分析的规律相一致，也与KOA发病机制相符合。

KEGG信号通路富集结果显示，枸杞子治疗KOA核心靶点基因参与的多条信号通路，主要涉及晚期糖基化终末产物-糖基化终末产物受体(AGEs-RAGE)、癌症、白介素17 (IL-17)信号通路等，其中AGEs-RAGE信号通路富集最显著，AGEs 通过与受体RAGE 结合产生氧化应激反应，激活大量促炎症细胞因子、生长因子和黏附分子等的表达和释放，使软骨细胞合成和分解代谢的失衡，进而调控细胞凋亡或存活、诱发炎症反应等[21-23]。相关研究发现IL-17 作为一种重要的炎症细胞因子，当KOA 关节液中IL-17 升高时，关节软骨IL-17信号通路关键蛋白，最终激活NF-κB，启动下游炎症反应[24]。王国良[25]、冯方等[26]研究发现KOA患者的滑膜液和滑膜中的IL-17 水平增加且与KOA严重性呈正相关，并且发现通过抑制IL-17 及其受体的生物学效应时可减轻关节炎的滑膜炎性反应，调节IL-17 基因表达水平可能会减轻患者临床症状。GO和KEGG富集结果表明，枸杞子治疗KOA作用机制涉及多个生物学过程和多条重要的信号通路。

综上所述，本研究通过构建“药物-成分-靶点-通路-疾病”网络，预测枸杞子治疗KOA的主要活性成分为槲皮素，以TNF、IL-6、AKT-1 为关键靶点，可能通过调控软骨细胞的代谢平衡、促进细胞增殖、分化、降低氧化应激反应、改善内环境的炎症反应等机制，为枸杞子在临床中作用于KOA 研究方面提供了方向和思路，但本研究通过调取相关数据库对药物的活性成分作用于疾病靶点及核心靶点基因参与的信号通路进行预测，仍存在一定的局限性，结论需进行后期实验研究加以验证。