分光光度法测定猪凝血酶稀释剂中氨丁三醇含量

余双英 刘璐 张军东

（1. 上海昊海生物科技股份有限公司 上海 201613；2. 上海利康瑞生物工程有限公司 上海 201707）

猪源纤维蛋白黏合剂在临床常用于手术中辅助止血，该产品生物相容性好、无毒无刺激，能有效黏附于创口起到良好的止血和促进创口愈合的作用[1-3]。猪源纤维蛋白黏合剂主要是由猪纤维蛋白原、猪凝血酶及相应的稀释剂组成的一种复合制剂，氨丁三醇作为猪凝血酶稀释剂的一种重要辅料，根据相关要求需控制其含量。因此，建立一种适合本产品中氨丁三醇含量的测定方法尤为重要。

国家药品标准[标准号：WS-10001-(HD-0467)-2002]氨丁三醇注射液[4]和《中华人民共和国药典》2020 年版四部药用辅料氨丁三醇中的含量测定均采用滴定法：以甲基红做指示剂，用盐酸滴定液（0.1 mol/L）滴定。但是在猪凝血酶稀释剂制备过程中添加了稀盐酸调节产品的pH，盐酸会对最终滴定结果有干扰，故排除滴定法。

氨丁三醇属带邻位的多羟基醇，相对分子质量较小，且没有紫外吸收，但能够在强碱条件下与氢氧化铜发生络合反应，生成深蓝色的氨丁三醇铜溶液，利用紫外-可见分光光度法测定络合物的吸光度，从而计算出氨丁三醇的含量。已有文献[5-6]采用紫外-可见分光光度法测定不同产品中氨丁三醇的含量，但本品中除氨丁三醇外还有其他一些对测定产生干扰的组分，不适合用于本品中氨丁三醇的测定。因此，本研究针对公司产品特点，对测定方法中采用的波长、硫酸铜及氢氧化钠溶液的浓度或用量、离心转速等条件均进行了改进，最终建立的方法操作简单，结果准确，并经过了方法学验证。

1 材料与方法

1.1 样品与试剂

猪凝血酶稀释剂（公司自产）；氨丁三醇对照品（中国食品药品检定研究院）；硫酸铜、氢氧化钠、盐酸（分析纯级，上海凌峰化学试剂有限公司）；氯化钙（药用级，广东省台山市新宁制药有限公司）。

1.2 仪器与设备

紫外- 可见分光光度计（Cary 60，Aglient Technologies）；ME104 和ME1002 分析天平、S220 pH计[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；H1650 台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）。

1.3 溶液配制

1）氢氧化铜悬浊液 在10 mL 离心管中分别依次加入5%氢氧化钠溶液3.5 mL 和15%硫酸铜溶液0.3 mL，立即振荡混匀，即得氢氧化铜悬浊液（需现配现用）。

2）对照品储备液（24 mg/mL） 精密称取对照品氨丁三醇0.6 g 于25 mL 容量瓶中，加水溶解后，稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。

3）线性溶液 分别精密量取0.25、0.40、0.50、0.60、0.75 mL 对照品储备液于10 mL 容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得一系列质量浓度分别为0.60、0.96、1.20、1.44、1.80 mg/mL 的线性溶液。

4）供试品储备液（24 mg/mL） 精密称取氨丁三醇0.6 g，置于25 mL 容量瓶中，加少量与凝血酶稀释剂中相同浓度的氯化钙溶液（45 mmol/L）溶解后，然后用氯化钙溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品样品储备液。

1.4 检测波长

制备4 组氢氧化铜悬浊液，各组中分别加入3 mL空白溶液（纯化水）、3 mL 空白基质（不含氨丁三醇的凝血酶稀释剂）、3 mL 对照品溶液（1.20 mg/mL）和3 mL 供试品溶液，立即振荡混匀，于10 000 r/min 离心5 min，取上清液再次于10 000 r/min 离心5 min，然后取上清液于400 ～800 nm 波长下进行全波段扫描，确定检测波长。

1.5 回归方程

取5 份氢氧化铜悬浊液，分别加入上述不同质量浓度的线性溶液3 mL，立即振荡混匀，于10 000 r/min 离心5 min，取上清液重复离心一次，然后取上清液在620 nm 波长下测吸光度，并以纯化水为空白对照。以吸光度对氨丁三醇浓度作线性回归，求得回归方程。

2 结果

2.1 检测波长的选择

对照品和样品溶液在620 nm 处具有最大吸收，而空白溶液和空白基质在该波长下基本没有紫外吸收（图1），表明此波长下测定的专属性较好，故选择620 nm 为测定波长。

图1 全波段扫描图

2.2 线性回归方程

经计算得线性回归方程为y=0.100 6x+0.011 9，相关系数r=0.998 5，说明氨丁三醇对照品溶液在0.579 3～1.737 9 mg/mL 范围内，氨丁三醇浓度和吸光度线性关系良好。

2.3 准确度

分别制备浓度为70%、100%、130%的样品液各3份进行测定，结果显示其平均回收率分别是100.21%、98.36%、97.59%；9 份样品液的平均回收率为98.72%（n=9），RSD 为1.46%（n=9）（表1），表明回收率较好。

表1 准确度测定

2.4 精密度（重复性/中间精密度）

两位研究人员于不同日期各测定供试品溶液6 份，测得氨丁三醇含量的平均值分别为1.166 4 mg/mL、1.114 6 mg/mL（n=6）；12 份样品的平均值为1.140 5 mg/mL（n=12），RSD 为3.59%（n=12），结果满足内控标准（RSD ≤5.0%）。

2.5 溶液稳定性

对照品和供试品溶液于室温放置0 或24 h，测定结果显示，两时间氨丁三醇含量测定结果的比值均满足内控标准（95.0%～105.0%）（表2），表明对照品和供试品溶液的稳定性良好。

表2 溶液稳定性

2.6 耐用性

在其他条件不变的情况下，分别调整离心转速为（10 000±500）r/min、检测波长为（620±2）nm、氢氧化钠浓度为5%±0.5%，氨丁三醇含量与正常条件下测得的结果比值均在95.0%～105.0%（表3），表明该方法耐用性良好。

表3 耐用性试验

2.7 供试品检测

取3 批猪凝血酶稀释剂（ 批号20201101、20201201、20201203），测得其氨丁三醇含量分别为1.183 2 mg/mL、1.201 4 mg/mL、1.167 9 mg/mL，说明该方法适用于猪凝血酶稀释剂中氨丁三醇含量测定。

3 讨论

1）离心条件的选择 在建立方法过程中比较了离心条件分别为8 000 r/min 离心2 次（5 min/次）、10 000r/min 离心1 次（5 min/次）和10 000 r/min 离心2 次（5 min/次，第一次离心后取上清液再次离心）对离心效果的影响，结果发现，前两种离心方式均会有少量片状沉淀漂浮在上层清液中，对测定结果产生干扰；而第三种离心效果相对较好，沉淀与上清液能够完全分离，从而使测定结果更加准确。

2）氢氧化铜悬浊液的制备 本方法根据产品特点，参考文献[6]调整了氢氧化钠和硫酸铜的用量，由于氢氧化铜悬浊液不稳定，需现配现用，且加入供试品溶液后需立即震荡混匀，否则氢氧化铜易分解产生黑色氧化铜沉淀，干扰测定结果。

方法改进后，采用紫外-可见分光光度法测定猪凝血酶稀释剂中氨丁三醇含量，方法简单、专属性强，且线性、精密度、准确度较好，样品中其他成分不干扰测定结果，是比较理想、便捷的一种含量测定方法。