青皮饮片、水煎液、配方颗粒的超高效液相色谱指纹图谱相关性研究

林荣楷 黄醒鹏 陈伟媚 邱彩月 冯倩仪 刘远俊 张正

青皮为芸香科植物橘CitrusreticulataBlanco及其栽培变种的干燥幼果或未成熟果实的果皮。青皮性温,味苦、辛,归肝、胆、胃经,有疏肝破气、消积化滞的功效,可用于胸胁胀痛、食积气滞等症[1]。现代研究表明,青皮主要含有黄酮类、生物碱类、挥发油类、氨基酸类等化学成分,具有抗氧化、抗休克、抗心律失常、利胆等药理作用[2-3]。

青皮配方颗粒是由青皮饮片经水提、固液分离、浓缩、干燥、制粒等步骤制备而成的颗粒,其因具备良好的药效,加上具有免煎煮、服用方便的优势,在临床上被广泛使用。《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》由国家药典委员会于2021年2月10日发布,其中对中药材、饮片、中间体、配方颗粒特征或指纹图谱做了“应具有相关性”的明确指示。目前关于青皮的特征图谱研究中,都是关于青皮药材、饮片、配方颗粒等的单一图谱研究[4-5]。因此,本研究拟对青皮配方颗粒原材料—中间体—终产品,即青皮饮片—水煎液—配方颗粒的超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography,UPLC)指纹图谱,以聚类分析(cluster analysis,CA)、主成分分析(principal component analysis,PCA)及正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)等统计学分析手段进行相关性研究,以期为青皮配方颗粒的生产过程控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1 实验仪器

Waters H-class型超高效液相色谱仪(美国Waters公司);XP26型百万分之一天平、ME204E型万分之一天平(瑞士METTLER TOLEDO公司);Milli-Q Direct型超纯水系统(德国Merck公司);SODA-12型喷雾干燥仪(上海大川原干燥设备有限公司);LGS20型干法制粒机(南京迦南科技有限公司)。

1.2 试药

辛弗林(批号:110727-202110,纯度99.80%)、橙皮苷(批号:110721-202019,纯度95.30%)、川陈皮素(批号:112055-202102,纯度99.70%)、橘皮素(批号:112054-202102,纯度99.70%)对照品均购自中国食品药品检定研究院;芸香柚皮苷(批号:ST05590120,纯度98.00%)对照品购自上海诗丹德标准技术服务有限公司;香蜂草苷(批号:17120103,纯度99.54%)对照品购自成都普菲德生物技术有限公司;甲酸为色谱纯(天津市科密欧化学试剂有限公司),乙腈、甲醇为色谱纯(德国Merck公司),水为超纯水,其余试剂为分析纯。

15批青皮药材(编号:S1～S15)经广东一方制药有限公司孙冬梅主任中药师鉴定均为芸香科植物橘CitrusreticulataBlanco的干燥幼果,符合2020年版《中国药典》一部青皮项下相关规定,药材产地信息见表1。15批青皮饮片(编号:Y1～Y15)由15批青皮药材严格按照2020年版《中国药典》一部青皮项下饮片炮制规定进行炮制[1];15批青皮水煎液(编号:J1～J15)由15批青皮饮片按照《医疗机构中药煎药室管理规范》的药材煎煮方法相关要求进行制备;15批青皮配方颗粒(编号:P1～P15)由15批青皮水煎液经浓缩、干燥、制粒等步骤制得。

表1 15批青皮药材的产地信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件[6]

色谱柱:Waters ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 μm);流动相:乙腈(A)-0.1%甲酸(B);梯度洗脱(0～2分钟,1%→8% A;2～5分钟,8%→13% A;5～12分钟,13%→19% A;12～13分钟,19%→22% A;13～20分钟,22%→35% A;20～21分钟,35%→51% A;21～30分钟,51%→54% A);流速:0.3 mL/min;柱温:40℃;检测波长:275 nm;进样量:1 μL。

2.2 对照品溶液的制备

取辛弗林、芸香柚皮苷、橙皮苷、香蜂草苷、川陈皮素、橘皮素对照品适量,精密称定,加甲醇制成质量浓度分别为15.802、55.633、65.720、55.154、80.268、80.824 μg/mL的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

2.3.1 青皮饮片供试品溶液 取青皮饮片粉末(过六号筛)约1.0 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加10%甲醇50 mL,称定重量,加热回流30分钟,取出,放冷,再称定重量,用10%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得饮片供试品溶液。

2.3.2 青皮水煎液供试品溶液 精密量取青皮水煎液10 mL,置具塞锥形瓶中,加12.5%甲醇40 mL,称定重量,按“2.3.1”项下制备方法,自“加热回流”起,依法制备,即得水煎液供试品溶液。

2.3.3 青皮配方颗粒供试品溶液 取青皮配方颗粒适量,研细,取约0.2 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加10%甲醇50 mL,称定重量,按“2.3.1”项下制备方法,自“加热回流”起,依法制备,即得配方颗粒供试品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性试验 分别精密吸取空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液适量,按“2.1”项下色谱条件进样测定,结果如图1所示,供试品溶液与对照品溶液在相应的保留时间处具有相同的色谱峰,且空白溶剂无干扰,表明该方法专属性良好。

注:峰1:辛弗林;峰3:芸香柚皮苷;峰4:橙皮苷;峰5:香蜂草苷;峰6:川陈皮素;峰7:橘皮素;A:空白溶剂;B:混合对照品溶液;C:饮片供试品溶液;D:水煎液供试品溶液;E:配方颗粒供试品溶液。

2.4.2 精密度试验 精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液,按“2.1”项下色谱条件连续进样6次,以4号峰橙皮苷为参照峰,计算各共有峰相对峰面积和相对保留时间的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD),均小于3%,表明仪器精密度良好。

2.4.3 重复性试验 取青皮饮片粉末(编号:Y2),精密称定6份,按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件进样测定。以4号峰橙皮苷为参照峰,计算各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD,均小于3%,表明该方法重复性良好。

2.4.4 稳定性试验 取青皮饮片粉末(编号:Y2),精密称定,按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件分别在制备0、2、4、8、12、24小时后进样测定。以4号色谱峰橙皮苷为参照峰,计算各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD,均小于3%,表明青皮饮片供试品溶液在24小时内稳定性良好。

2.5 UPLC指纹图谱的建立与相似度评价

2.5.1 指纹图谱的建立 分别取15批青皮饮片、水煎液及配方颗粒,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件进样测定,记录色谱图。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”分别对色谱图进行匹配,建立共有模式图,并分别生成对照指纹图谱R1、R2和R3,结果如图2～4所示。15批青皮饮片、水煎液及配方颗粒的UPLC指纹图谱均标记出7个相同的共有峰,通过与对照品图谱对比,确定1号峰为辛弗林、3号峰为芸香柚皮苷、4号峰橙皮苷、5号峰为香蜂草苷、6号峰为川陈皮素、7号峰为橘皮素。

图2 15批青皮饮片的UPLC指纹图谱堆叠图(对照指纹图谱R1)

图3 15批青皮水煎液的UPLC指纹图谱堆叠图(对照指纹图谱R2)

图4 15批青皮配方颗粒的UPLC指纹图谱堆叠图(对照指纹图谱R3)

2.5.2 相似度评价 将15批青皮饮片、水煎液及配方颗粒UPLC指纹图谱的数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”软件,分别计算各批次青皮饮片、水煎液及配方颗粒指纹图谱与各自对照图谱的相似度,结果见表2。15批青皮饮片、水煎液、配方颗粒指纹图谱与其相应对照指纹图谱的相似度分别大于0.890、0.910、0.910,相似度较高,表明不同批次青皮饮片、水煎液、配方颗粒间的质量均较为稳定。

表2 15批青皮饮片、水煎液及其配方颗粒UPLC指纹图谱相似度评价结果

2.5.3 对照指纹图谱的比较 将15批青皮饮片、水煎液及配方颗粒UPLC指纹图谱生成的对照指纹图谱R1、R2和R3导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”软件,结果见表3和图5。青皮饮片、水煎液、配方颗粒三者对照指纹图谱之间的相似度均大于0.970,表明三者对照指纹图谱的主要色谱峰一致,青皮饮片经水煎煮后成分无明显变化,反映出青皮配方颗粒的制备工艺稳定可行。

注:峰1:辛弗林;峰3:芸香柚皮苷;峰4:橙皮苷;峰5:香蜂草苷;峰6:川陈皮素;峰7:橘皮素。

表3 青皮饮片、水煎液、配方颗粒的对照指纹图谱相似度评价结果

2.6 化学模式识别研究

2.6.1 共有峰相关性分析 以15批青皮饮片、水煎液、配方颗粒共45个样品各特征峰的“峰面积占比”值(各特征峰峰面积占特征峰总面积的比例)为变量,利用SPSS 26.0软件进行斯皮尔曼相关性分析[7],结果见表4。青皮饮片分别与水煎液、配方颗粒比较,辛弗林、芸香橙皮苷、香蜂草苷、川陈皮素、橘皮素均具有极显著的正相关性关系,峰2具有显著的正相关关系;青皮水煎液与配方颗粒比较,全部共有峰均具有极显著的正相关性关系。

表4 15批青皮饮片、水煎液、配方颗粒指纹图谱共有峰的相关性分析结果

2.6.2 聚类分析(CA) 以15批青皮饮片、水煎液、配方颗粒共45个样品各特征峰峰面积为变量,利用SPSS 26.0软件进行聚类分析[8],结果如图6。CA结果显示,45个样品可聚为两类,青皮饮片单独聚为一类,青皮水煎液和青皮配方颗粒聚为一类,说明水煎液与配方颗粒的指纹图谱较为相似,质量更为接近。

图6 青皮饮片、水煎液和配方颗粒UPLC指纹图谱CA图

2.6.3 主成分分析(PCA) 以15批青皮饮片、水煎液和配方颗粒共45个样品各特征峰的峰面积为变量,利用SPSS 26.0软件,进行主成分分析[9],PCA结果以特征值>1为分析标准,提取得到2个主成分,计算其特征值和方差贡献率及主成分因子载荷矩阵,结果见表5～6。由结果可知,前两个主成分累积方差贡献率为89.250%,能较全面地反映青皮指纹图谱的基本信息。主成分1的特征值为4.343,方差贡献率为62.039%,载荷较高的峰有辛弗林、峰2、芸香柚皮苷、橙皮苷、香蜂草苷和川陈皮素,表明这6个峰主要反映主成分1的信息;主成分2的特征值为1.905,方差贡献率为27.211%,载荷较高的峰有橘皮素,表明橘皮素主要反映主成分2的信息。由图7可知,青皮饮片与其他样品距离较远,表明青皮水煎液与配方颗粒中的部分成分含量与饮片存在一定差异,这可能是由于水煎液的的提取溶剂为水,未能将饮片中低极性成分提取完全;水煎液与配方颗粒样品相互交叉,相距较近,表明青皮水煎液与配方颗粒在成分上具有较大相关性,差异较小,与CA结果一致。

图7 青皮饮片、水煎液和配方颗粒UPLC指纹图谱主成分得分图

表5 青皮饮片、水煎液和配方颗粒UPLC指纹图谱PCA特征值及方差贡献率

表6 青皮饮片、水煎液和配方颗粒UPLC指纹图谱主成分因子载荷矩阵

2.6.4 正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA) 以15批青皮饮片、水煎液和配方颗粒共45个样品各特征峰峰面积为变量,利用SIMCA 14.1软件,进行正交偏最小二乘法判别分析[10],结果如图8～9所示。由模型参数可知,数据矩阵的模型解释率R2X(cum)为0.904,模型区分率R2Y(cum)为0.654,模型预测参数Q2(cum)为0.572。45个样品可大致分成2类,水煎液和配方颗粒更为接近,与CA、PCA结果一致。以VIP值大于1为分析标准,得出结论:橙皮苷、川陈皮素、芸香柚皮苷是影响分类的主要标志性成分。

图9 15批青皮饮片、水煎液及配方颗粒OPLS-DA VIP值图

3 结论

中药配方颗粒是20世纪末以来,我国对中药传统汤剂剂型进行积极“转型”的适配产物之一,是传统中药饮片具创新性的应用形式[11]。郭东晓等[12]提出,过程评价的开展有助于配方颗粒质量评价体系的完整性。

本研究对青皮配方颗粒饮片、水煎液、配方颗粒的UPLC指纹图谱相关性进行研究。研究结果表明,三者的UPLC指纹图谱均确立了7个共有峰,并指认了其中6个共有峰。相似度评价结果表明,青皮饮片、水煎液、配方颗粒三者对照指纹图谱之间的相似度均大于0.970,表明三者的化学成分基本一致;斯皮尔曼相关性分析结果显示,辛弗林、芸香橙皮苷、香蜂草苷、川陈皮素、橘皮素在青皮饮片、水煎液及配方颗粒之间均呈现极显著的正相关性。CA、PCA和OPLS-DA结果均显示,青皮饮片单独聚为一类,水煎液和配方颗粒聚为一类,可能是由于橙皮苷等成分水溶性较差[13]、水煎液提取溶剂与饮片供试品提取溶剂极性差异等造成的;而从水煎液到配方颗粒,各类化学成分均得到较好的转移,说明青皮配方颗粒的制备工艺稳定、合理。OPLS-DA结果显示,橙皮苷、芸香柚皮苷、川陈皮素是影响分类的主要标志性成分,说明这三个成分含量在生产过程中变化较明显。

综上,青皮配方颗粒饮片、水煎液、配方颗粒的UPLC指纹图谱符合国家药典委员会《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》一文“应具有相关性”的要求,表明所选制备工艺稳定、可行。

本研究阐明了青皮配方颗粒与饮片、水煎液在化学成分上的相关性与差异性,为青皮配方颗粒的生产过程质量控制及质量评价提供了研究基础;同时也进一步完善了中药配方颗粒质量评价体系的完整性,将有助于中药配方颗粒的进一步推广与使用。