蠲痹汤“异病同治”法治疗类风湿关节炎和强直性脊柱炎的网络药理学作用机制研究*

刘 宁，徐展望，王明喜，谭国庆△

1 山东中医药大学，山东 济南 250035； 2 山东中医药大学附属医院，山东 济南 250035

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以关节侵袭性炎症为特征的全身免疫性疾病，可造成关节对称性骨组织破坏，甚至导致关节畸形及功能障碍，严重影响患者生活质量［1］，但是目前RA的确切发病机制尚不清楚［2］。强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）同样属于慢性炎症性风湿免疫疾病，常累及骶髂及中轴关节，后期出现“竹节样”改变、活动障碍、慢性疼痛等症状，同样存在软骨变形、骨破坏等表现，具有较高致残率［3］。RA 与AS 是临床最常见的慢性风湿骨科疾病，给患者及社会带来深重负担，但免疫抑制剂、糖皮质激素、生物制剂等临床常用药物均存在不同程度不良反应［4］，因此寻找安全有效的治疗方法迫在眉睫。而近年来随着中医药的不断发展，中药组方在治疗RA 及AS 方面取得良好疗效，并且安全性得到广泛认可。

《素问·痹论篇》指出：“风、寒、湿三气杂至，合而为痹。”风寒湿等邪气痹阻经络关节，影响气血运行，导致筋骨慢性疼痛，RA 及AS 均可归为中医“痹证”范畴。蠲痹汤出自《医学心悟》，由羌活、独活、肉桂、秦艽、当归、川芎、甘草、海风藤、桑枝、乳香、木香等药物组成。方中羌活、独活、秦艽、海风藤、桑枝祛风除湿，肉桂温通经脉、散寒止痛，当归、乳香、川芎、木香养血活血、行气止痛，甘草调和诸药。全方祛风除湿，蠲痹止痛。近年来，蠲痹汤随证加减在临床治疗“痹证”过程中取得显著疗效［5］。

网络药理学整体、系统的特点符合中医整体观及辨证论治理论，为进一步挖掘中药药理作用机制提供了科学方法［6］。RA 及AS 在发生发展过程中具有共同的病因病机。本研究基于中医“异病同治”理论，依托网络药理学相关技术方法探讨蠲痹汤干预RA及AS的可能作用机制。

1 资料与方法

1.1 RA 与AS 靶基因预测以“rheumatoid arthritis”“ankylosing spondylitis”作为 关键词，在疾病基因数据库（DisGeNET），人类基因数据库（GeneCards），人类孟德尔遗传综合数据库（OMIM），综合型药物数据库（DrugBank）以及治疗靶标数据库（TTD）等5 个数据库中，对RA 及AS 已知靶基因进行检索与筛选，合并各数据库的疾病靶基因，可获得已明确的疾病靶点。

1.2 蠲痹汤有效成分筛选及靶点预测在中药系统药理学技术平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database platform，TCMSP）上，以蠲痹汤11 味中药检索其化学成分、口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（drug likeness，DL）≥0.18、药物对小肠上皮细胞的穿透性（caco-2）≥-0.4、180≤分子量（MW）≤500、脱水分配系数（AlogP）＜5 作为活性化合物的筛选条件［7］，对具有较高活性的化合物进行筛选提取，将得到的活性成分通过有机小分子生物活性数据库（PubChem）获得相对应的SMILES 及2D 结构，并将2D 结构保存为sdf 格式。后将结构导入Swiss Target Prediction 及DrugBank 数据库中对靶点进行预测，相似性阈值取为0.85，并把人类基因型作为条件筛查。导入蛋白质数据库（Unitprot）进行基因的标准化处理。利用Cytoscape 3.7.2 软件，构建其有效成分-靶点网络图。

1.3 蠲痹汤治疗RA与AS的关键靶基因筛选将筛选出的蠲痹汤潜在靶基因与“1.1”项获取的疾病靶基因交叉生成Venny 图，得出蠲痹汤治疗RA与AS 的映射靶基因，并借助Cytoscape 3.7.2 软件构建关键靶点PPI 网络图，根据节点连接度（degree）值的大小进行筛选，得到蠲痹汤治疗RA与AS 的核心靶基因，所获取的靶基因则是同时对RA与AS起到调控作用的核心靶点，揭示出蠲痹汤干预RA及AS的可能作用机制。

1.4 生物通路及富集分析将“1.3”项筛选出的核心靶基因导入基因功能注释数据库（DAVID），进行基因和基因组的京都百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析及基因本体论（gene ontology，GO）生物过程的富集分析。以P≤0.05 为筛选标准，分别将筛选出的前20 个GO 条目与KEGG 条目借助OmicShare 云平台绘制富集分析气泡图。

2 结果

经TCMSP数据库筛选出153个活性成分，其中大于平均自由度的活性成分76 个，见表1。具有137 个靶点，活性物质-靶点关系网络，见图1。经相关疾病数据库搜索查重后，共选出RA与AS已知靶基因分别为729个、188个。映射出关键靶点23个，生成韦恩图，见图2。依托Cytoscape 3.7.2软件构建相互作用PPI 网络，见图3，平均节点连接度（degree）为10.3，以degree≥11 筛选到核心靶点10个。经DAVID数据库获得119项GO富集结果及32 条KEGG 信号通路，通路下所含靶点见表2。以P值升序排列，分别筛选出符合条件的20个生物过程和信号通路，并将其以气泡图的形式展现出来，见图4—5。

图1 活性物质-靶点网络图

图2 映射靶点韦恩图

图3 关键靶点相互作用PPI网络

图4 GO富集分析气泡图（前20条）

图5 KEGG通路分析气泡图（前20条）

表1 活性成分表

表2 KEGG通路下所含靶基因（前20条）

3 讨论

TCMSP 数据库能够充分挖掘中药潜在活性成分，通过相关参数筛选认为槲皮素、山柰酚、芒柄花黄素等是蠲痹汤的主要活性成分，基于“异病同治”理论，以上活性物质均可有效作用于RA 与AS的发生发展过程。槲皮素（quercetin）是具有抗氧化、抗炎作用的天然黄酮类物质，在各种骨关节炎症中具有显著作用。研究发现，诱导性关节炎大鼠模型关节腔液及软骨中IL-1β、MMP-13 等炎症相关因子水平表达升高，诱导了软骨细胞凋亡，而槲皮素抑制NF-κB 激活后会改善相关炎症环境，减少细胞凋亡，起到保护软骨的作用［8］。此外滑膜成纤维细胞的异常增殖也会造成炎症介质释放及浸润，降解细胞外基质，造成软骨和骨质的损害。PAN等［9］研究发现，槲皮素通过上调长链非编码RNA MALAT1 表达，诱导滑膜成纤维细胞的凋亡过程，达到改善RA 症状保护关节软骨的目的。AS同样是一种长期慢性炎性疾病，各种免疫因子、炎症细胞在AS 发病过程中具有重要作用［10］。研究发现AS 患者骶髂关节肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）呈高度表达，长期炎症刺激引起椎板间小关节融合，同时韧带炎症复合物堆积引起腰背痛及晨僵［11］。研究显示，槲皮素同样能够下调RAFLS 的活性，抑制其增殖及迁移，进而降低T 细胞所介导的炎性因子释放，有效改善关节炎症状［12］。山柰酚的抗炎作用同样明显，通过调节炎症基因转录及促炎酶活性，抑制转录因子、黏附分子表达调节炎症水平［13］。动物实验表明，山柰酚可通过上调叉头框蛋白P3（forkhead box protein P3，FOXP3）表达水平改善胶原诱导关节炎症状，同时山柰酚减少FOXP3磷酸化，可能是山柰酚在预防和治疗RA与AS等炎症性疾病中的基础［14］。

通过PP网络可以看出靶点间具有复杂协同作用，干预RA与AS的发生发展过程，TNF、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGF）、白细胞介素6（Interleukin-6，IL-6）、白细胞介素1B（Interleukin-1B，IL-1B）等核心靶点具有较高自由度，可能起到关键作用。IL-6 拮抗剂在类风湿关节炎临床应用中的良好疗效说明了IL-6 在RA 中的重要地位。研究发现，IL-6 在RA关节液中检测到极高活性，其一方面促进RAFLS增殖，发生炎性浸润及软骨损伤；另一方面能够增强白细胞介素1（Interleukin-1，IL-1）在RA 中的相关生物活性［15］。IL-1 主要由滑膜细胞产生，能够诱导滑膜、软骨细胞合成前列腺素E2和胶原酶，引发软骨破坏。相关研究发现，IL-1是AS的易感基因，AS 患者体内IL-1 水平明显高于对照组，同时IL-1B 因为能够分泌于细胞外部，远距离作用于靶细胞，所以在AS 炎症中具有重要作用［16］。而IL-6 是T 细胞亚群分化的关键细胞因子，能够持续诱导Th17细胞产生，参与AS免疫调节及免疫病理过程［17］。TNF-α 在炎症反应中重要的促炎及免疫调节因子，TNF-α 的表达与IL-1、IL-6 呈正相关，当TNF-α 表达受抑制时，IL-1、IL-6 的产生也会相对减少［18］。TNF-α也能发挥类似IL-1生理作用，通过影响COX 对前列腺素的合成来抑制RA。TNF-α 也被认为是AS 的关键因子，因为在AS 患者骶髂关节部位存在明显炎性浸润及TNF-α 水平升高［19］。除上述讨论外，血管生成构建也伴随两种疾病的发生发展。

AS 的早期病理变化是小关节滑膜炎，而此期间的滑膜翳生成、滑膜细胞增生均与血管通透性增加、血管过度增生有关［20］，VEGFA 的表达能够调控血管生成与通透性。马莉等［21］研究发现，VEGF主要参与滑膜翳生成，血管通透性增加在滑膜细胞增生方面其重要调控作用。滑膜翳生成同样普遍存在于RA 患者，并且其微环境主要特征是缺氧，血管构建及通透性增加能够从一定程度上改善缺氧状态。综上所述，蠲痹汤通过多靶点“异病同治”RA 与AS，并且众多炎症因子协同作用调控体内炎症氧化水平是治疗的关键。

靶点间相互联系进而调控体内多种生物过程，并且通过通路产生联级反应干预疾病过程。富集分析发现蠲痹汤“异病同治”RA 与AS 还涉及一氧化氮生物合成过程的正调控、细胞因子活性、细胞对脂多糖的反应、降钙素1-单加氧酶活性的正调控等多个生物过程。KEGG 通路分析也发现除非特异性通路外TNF 信号通路、NOD 样受体通路、Toll 样受体通路、HIF-1 信号通路等多条通路在RA 与AS 中具有重要作用。TNF 信号通路是典型的炎症通路，IL-6、IL-1B、TNF 等多种炎性因子均是其通路下游靶点，并通过相互协同作用调控体内氧化应激水平及炎症反应，干预RA与AS发生发展过程。先天性免疫应答是机体抗炎症免疫的首要防线，NOD 样受体及TOLL 样受体是其两种非特异性的模式识别受体。NOD 样受体主要存在于细胞质内调控炎症反应，动物实验发现通过NOD1/NOD2 能够增强NOD 样受体激动剂所有诱导的白细胞介素分泌，进一步调节Th1、Th2 和Th17细胞的炎症免疫［22］。此外NOD 样受体通路还能够转导NF-κB 通路、MAPK 通路诱导CCL2 的分泌，调节T细胞应答［23］。Toll样受体主要集中于细胞膜表面，同样能够激活NF-κB 通路、MAPK 通路分泌IL-1、IL-6、TNF-α等多种炎性因子，同时激活T细胞参与滑膜炎性反应及骨破坏［24］。因此下调NOD样受体通路、Toll样受体通路可能成为治疗RA与AS的关键。缺氧是RA典型的微环境，而低氧诱导因子（hypoxia-inducible factor，HIF）能够调节低氧环境适应性，进而调控RA 患者滑膜炎症以及软骨破坏等生物过程［25］。HIF-1α 不仅能够通过调控一系列趋化因子促进纤维滑膜细胞迁移增殖，同时还能够增强Toll 样受体先天免疫功能发挥作用，促进炎症因子的表达［26］。在强直性脊柱炎的发展过程中，炎性反应浸润导致局部缺氧，从而导致血管新生，改善缺氧又促进炎性因子迁移浸润。HIF-1在AS病程中主要调控以下方面：关节滑膜新生、调节炎症反应、参与局部病变等。综上所述，蠲痹汤通过多条炎症相关通路能够同时治疗RA 与AS 两种疾病，起到“异病同治”的治疗作用。

从中医角度来看，不同疾病在发展的不同阶段会产生相同或相近的病理变化，根据辨证论治的原则，治法也就相同，称为“异病同治”。炎症反应及体内氧化应激普遍存在于RA 与AS 的发生发展过程，而本文通过网络药理学较为科学的发现蠲痹汤众多活性物质均是通过诱导相关炎症靶点作用于多条特异性通路来调节体内炎症水平，达到改善RA与AS临床症状的治疗目的。