基于网络药理学和实验验证研究加味独活寄生合剂治疗腰椎间盘突出症的作用机制

蒋浩波，段嘉豪，刘恩旭，陈 茜，李 夏，邵 乐，杨少锋*，张 晓*

1.湖南中医药大学，湖南 长沙410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙410007；3.广东医科大学公共卫生学院，广东 东莞523808

近几十年来，腰痛已成为影响人们生活质量最为重要的筋骨疾患之一[1]。 相关研究表明，高达84%的人在其一生中都可能会受到腰痛的困扰[2]。 其中，腰椎间盘突出症（lumbar disc herniation, LDH）是导致腰痛最为常见的原因之一[3]，它的发生与腰椎退行性改变密切相关。 LDH 指椎间盘发生退行性改变后，由于纤维环部分或全部破裂，单独或连同髓核、软骨终板向外突出，刺激或压迫脊髓、神经和血管等组织，引起以腰腿痛为主要症状的病变。 椎间盘主要由上下终板软骨（endplate cartilage, EPC）、纤维环（annulus fibrosus, AF）、纤维环包裹的髓核（nucleus pulposus, NP）组成。 由于椎间盘内无血管分布，其营养主要依靠终板软骨的扩散。 随着人年龄的增长，终板软骨细胞发生退变，终板软骨的营养供给功能障碍，导致椎间盘衰老变性，进而引起LDH[4-5]。

LDH 归属于中医学“痹病”范畴，相关研究表明中医在LDH 的保守治疗中疗效显著[6]。腰为肾之府，肾主骨，生髓，为先天根本；肝为藏血之脏，在体合筋；当肝肾亏虚时，则精血生发较少，无法滋骨络髓，无法荣筋，而发腰痹，所以肝肾亏虚为LDH 的主要内因。 因此，以独活寄生汤为代表的经典方剂，在治疗LDH 方面得到了广泛应用[7-8]。加味独活寄生合剂是在独活寄生汤的基础上，经临床辨证论治、三因制宜对药味、药量进行加减的院内制剂，其对于痹病（风寒湿痹、肝肾不足）有着良好的临床疗效，在保守治疗的情况下，加味独活寄生合剂治疗LDH 有效率达到80%[9]。

因中药复方成分的复杂性和靶点的不确定性，常规药理研究方法难以全面阐明加味独活寄生合剂治疗LDH 的分子作用机制。网络药理学作为药理学新兴分支学科，在揭示化学成分复杂的中药复方的药理学规律上具有独特的优势，其整体性、系统性与中医药的整体观、辨证论等基本理论趋于一致[10-11]。 因此，本研究设计通过网络药理学技术获取加味独活寄生合剂干预LDH 交集靶标，得到交集靶标以及富集通路，并预测相关机制；最后通过大鼠椎间盘软骨终板细胞的体外实验进行验证，为深入探讨加味独活寄生合剂干预LDH 的机制提供可靠的理论依据。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

健康1 月龄SPF 级SD 大鼠20 只，雄性，质量（200±20） g；由湖南中医药大学动物实验中心代购。质量合格证编号为：ZS-202209200008。 对于动物的实验操作均经过湖南中医药大学伦理委员会审核，伦理号为：LLBH-202209050004。大鼠4 只用于原代终板软骨细胞的提取；8 只用于加味独活寄生合剂含药血清的提取，8 只用于无药血清的提取。

1.2 实验用药

加味独活寄生合剂，批号：2022111，湘药制备字：Z20190063，规格：每瓶250 mL。 主要成分：独活、桑寄生、天南星、黄芩、木瓜、威灵仙、杜仲、牛膝、细辛、秦艽、茯苓、肉桂、防风、川芎、人参、甘草、当归、白芍、熟地黄。 生药浓度为0.664 g/mL。

1.3 主要试剂及仪器

CCK-8 细胞活力检测试剂盒（批号：PN659）购自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司；PBS 缓冲液（批号：PB180327）购自武汉普诺赛生命科技有限公司；IL-6 ELISA 试剂盒（批号：Y17039786）购自武汉华美生物工程有限公司；重组人IL-17（批号：Q16552）购自美国PeproTech 公司；DAPI（批号：C1005）购自上海碧云天生物技术有限公司；Collagen Ⅱ抗体（种属：兔）（批号：ab34712）购自英国Abcam 公司；Trizol试剂（批号：5301100）购自美国Thermo 公司；mRNA逆转录试剂盒（批号：E047-01B）购自中国北京康为世纪；p-p65 抗体（批号：3033S）、MMP9 抗体（批号：2270S）；GAPDH 抗体（批号：2118S）以上抗体均购自美国CST 公司。

A00-1-1102 型流式仪（Beckman 公司）；PW-812 型全自动酶标洗板机（深圳市汇松科技发展有限公司）；MB-530 型多功能酶标分析仪（深圳市汇松科技发展有限公司）；PIKOREAL96 型荧光定量RCP 仪（美国Thermo 公司）；DYY-2C 型电泳仪、DYCP-31DN 型水平琼脂糖电泳槽（中国北京六一公司）；GL-88B 型旋涡混合器（中国江苏其林贝尔公司）。

2 方法

2.1 网络药理学分析

2.1.1 获取交集靶标 应用TCMSP 数据库（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）及BATMAN-TCM 数据库（http:/bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）检索加味独活寄生合剂所有组成药物的活性成分。 筛选出类药性（drug-likeness, DL）≥0.18、口服生物利用度（oral bioavailability, OB）≥30%的化合物作为研究对象， 然后基于该数据库，将纳入的活性成分逐一配对潜在作用靶点。 再通过UniProt 数据库（https://www.uniprot.org/）进行靶点蛋白和基因信息注释，限定物种为“Homo sapiens”，得到加味独活寄生合剂主要活性成分的预测靶点。 通过GeneCards 数据库（https://www.genecards.org/）、OMIM 数 据 库（https://omim.org/）搜集LDH 相关的疾病靶点，并将化合物作用靶点与疾病靶点取交集，获取加味独活寄生合剂干预LDH的交集靶标。

2.1.2 构建“药物-化合物-疾病靶标”网络模型 将交集靶标入Cytoscape 3.7.0 软件中构建“药物－化合物－疾病靶标”网络图以备后续分析。 其中节点的类型代表药物成分、疾病和交集靶标，利用CentiScape插件计算有效成分的度值，度值越高提示发挥主要功能的概率越大。

2.1.3 构建PPI 网络获取核心靶蛋白 将获得的交集靶标输入STRING（https://string-db.org/）数据库，将蛋白种类设置为“Homo sapiens”，将Settings 设为“high confidence：0.7”，其他参数保持默认设置，获得PPI 网络。 并导入Cytoscape 3.7.0 绘制蛋白质间相互作用网络并进行网络拓扑分析，根据度值大于中位数筛选出核心靶蛋白。

2.1.4 GO 分析及KEGG 通路富集分析获取关键通路 用R 语言（https://www.r-project.org/）软件中clusterProfiler GO.R 插件及Perl 语言对活性成分与LDH 的交集靶标进行GO 分析。 并应用clusterProfilerKEGG.R 插件进行KEGG Pathway 通路富集分析。根据富集因子值分析核心通路富集程度，探究加味独活寄生合剂治疗LDH 的可能的生物功能及信号通路机制。

2.2 体外实验验证

2.2.1 终板软骨细胞的提取、培养和鉴定 取健康1 月龄SD 大鼠4 只，使用3%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，脊柱脱臼法处死，使用75%乙醇浸泡5 min，移至超净工作台。 俯卧固定大鼠，剪开被毛，暴露完整椎体，取出椎间盘终板软骨组织。将组织用无菌PBS 清洗3 次， 剪碎至1 mm3大小，加入5 mL 0.2%Ⅱ型胶原酶消化液，37 ℃恒温摇床，震荡消化2～3 h。吹打组织30 次，经过200 目细胞筛过滤，滤液1 000 r/min 离心5 min，离心半径9 cm。去除上清液后，用含10%胎牛血清以及1%双抗（青霉素/链霉素）的DMEM 培养液将收集的终板软骨细胞重悬，并接种在25T 的培养瓶内，放置在恒温培养箱（37 ℃、5% CO2）中培育。24 h 后观察细胞贴壁情况，若贴壁情况良好，则3 d 后对细胞进行第一次换液，之后每隔2～3 d 换一次液。 当第三代细胞增长至80%后取出细胞，通过细胞形态学观察以及CollagenⅡ免疫荧光染色进行鉴定，鉴定成功后，取出第三代终板软骨细胞进行后续实验。

2.2.2 加味独活寄生合剂药液的制备 采取蒸馏法，浓缩药液至2 g/mL。

2.2.3 含药血清的制备 1 月龄SD 大鼠16 只，适应性喂养7 d，按随机数表法分为加味独活寄生合剂组和生理盐水组。 按照药理试验中动物与人体间的等效剂量换算[12]。 加味独活寄生合剂参考人体剂量（1.186 g·kg-1·d-1），并按人（70 kg）和大鼠（200 g）体表面积折算等效剂量，大鼠等效剂量约为7.35 g·kg-1·d-1。 据相关研究表明，当大鼠灌胃剂量达到临床等效剂量5 倍时取得的大鼠含药血清质量最高[13]，因此，大鼠需要药物剂量为36.75 g·kg-1·d-1。 浓缩后的药液需要灌18.375 mL·kg-1·d-1，生理盐水组灌等量的生理盐水，分早晚两次灌胃。 灌胃第7天给药1 h 后，使用3%的戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉采血，常温静置3 h；以3 000 r/min、离心半径9 cm、4 ℃条件下离心15 min，按组收集血清。 将各组血清组内混合，减少个体差异。 于56 ℃的恒温水浴锅中放置30 min 灭活，0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌，保存在1.5 mL 离心管内，做好标记，放置-80 ℃冰箱保存备用。

2.2.4 造模方法 使用添加含有10 ng/mL 的IL-17 的DMEM 培养液对第3 代终板软骨细胞进行培养，经过24 h 诱导后形成终板软骨细胞退变模型[14]。通过倒置显微镜、甲苯胺蓝染色以及CollagenⅡ免疫荧光染色鉴定细胞并观察细胞退变情况。

2.2.5 含药血清毒性检测 终板软骨细胞以5×103个/cm3的密度接种到96 孔板中，分别加入200 μL含有0%、5%、10%、20%、40%、60%、80%、100%含药血清的基础培养基干预24 h。干预后，将含10%CCK-8 的100 μL 基础培养基加入孔板，37 ℃孵育2 h。 使用酶标仪检测波长在450 nm 处测量每个孔的吸光度值（optical density, OD）值。 检测细胞活性，分析含药血清毒性。 CCK-8 实验计算细胞活力，细胞活力（%）=[（实验孔-空白孔）/（对照孔-空白孔）]×100%。

2.2.6 分组及干预 取P3 代终板软骨细胞，按随机数字表法随机分成5 组：空白对照组、模型对照组、加味独活寄生合剂低剂量组（简称低剂量组）、加味独活寄生合剂低剂量组中剂量组（简称中剂量组）、加味独活寄生合剂高剂量组（简称高剂量组）。 除空白对照组外，其他4 组均采用IL-17 干预大鼠的椎间盘终板软骨细胞。 IL-17 干预细胞后使用不同浓度含药及空白血清干预各组细胞。

各组具体干预方式为：空白对照组：20%空白血清+DMEM；模型对照组：20%空白血清+DMEM+10 ng/mL IL-17；低剂量组：5%含药血清+15%空白血清+DMEM+10 ng/mL IL-17；中剂量组：10%含药血清+10%空白血清+DMEM +10 ng/mL IL-17；高剂量组：20%含药血清+DMEM+10 ng/mL IL-17。

2.2.7 各组终板软骨细胞的细胞活性检测 为了测定各组细胞增殖活性情况，将终板软骨细胞以5×103个/cm3的密度接种到96 孔板中。 完成上诉干预后，将含10% CCK-8 的100 μL 基础培养基加入孔板，37 ℃孵育2 h。 使用酶标仪检测波长在450 nm处测量每个孔的OD 值，计算细胞活力。

2.2.8 各组终板软骨细胞的细胞周期情况检测 胰酶消化收集各组细胞，PBS 冲洗3 遍，1 000 r/min，离心半径9 cm，3 min 收集细胞沉淀。 加入1 mL 70%的预冷的乙醇固定细胞24 h；重悬离心2 遍去除乙醇后，加入200 μL 碘化丙啶（PI）工作液，4 ℃避光染色30 min。 转至流式检测管，上机检测，PI 用488 nm 氩离子激光器激发，由630 nm 通滤光片接收，通过FSC/SSC 散点图收集10 000 个细胞，采用设门技术，排除粘连细胞和碎片，分析PI 荧光直方图上各细胞周期的百分率。

2.2.9 ELISA 检测各组细胞IL-6 的表达 收集各组干预完成后的细胞上清液，分别设标准孔和待测样本孔，操作步骤按照试剂盒说明进行。 用酶标仪在450 nm 波长依序测量各孔的光密度OD 值。 以标准品的浓度为纵坐标，OD 值为横坐标，使用Curve Expert 软件进行分析，计算出样本浓度。

2.2.10 实时荧光定量PCR 检测各组细胞p-p65、MMP9 的基因表达 应用Trizol 试剂提取各组细胞总RNA。按照试剂操作盒说明书进行逆转录反应得到cDNA，作为扩增模板，扩增条件如下：95 ℃，10 min；95 ℃，15 s，60 ℃，30 s，40 个循环，熔解曲线分析：60 ℃- 95 ℃。 根据2-△△Ct法计算目标mRNA 的相对表达量，上下游引物由北京擎科生物科技有限公司合成；引物序列：p-p65：正向5'-CCGATGCATCCACAGTTCCC-3'， 反 向5'-TGGGGGCACGGTTAT CAAAA-3'，长度：156 bp。 MMP9：正向5'-AGGGCCCCTTTCTTATTGCC-3'，反向5'-CACATTTTGCGCCCAGAGAA-3'，长度：112 bp。 GAPDH：正向5'-TCACTATGAGGTCTACTCGG-3'，反向5'-CATATTGCCAGTTCTTCGTA-3'，长度：141 bp。

2.2.11 Western blot 法 检测 各组p-p65、MMP9 的表达 各组细胞干预24 h 后弃上清，PBS 洗涤后加入细胞裂解液和苯甲基磺酰氟（PMSF）， 冰上裂解30 min 后12 000 r/min，离心半径5 cm，离心15 min，吸取上清并加入缓冲液，100 ℃金属浴5 min 后放入-80 ℃冻存。 选用8%～12%的分离胶进行电泳，随后将蛋白转移至PVDF 膜上，使用5%脱脂奶粉封闭1 h 后加入稀释后的一抗（1∶1000）放入4 ℃过夜，TBST 清洗3 次，8 min 后用稀释后的二抗（1∶5000）孵育1 h， 再次使用TBST 洗膜后加入ECL 液上机显影。 内参为GAPDH，使用Image J 软件分析pp65、MMP9 蛋白的相对表达量。

3 结果

3.1 网络药理学分析结果

3.1.1 加味独活寄生合剂治疗LDH 的潜在靶点的确定 通过TCMSP 数据库及BATMAN-TCM 数据库检索并经文献补充后，共筛选出加味独活寄生合剂19 种药物共计295 种活性成分，见图1A。 通过TCMSP 数据库获取及SwissTarget 数据库预测的靶点经UniProt 数据库规范化处理，得到257 个活性成分作用靶点，通过GeneCards、OMIM 数据库共搜集得到498 个LDH 疾病靶点，加味独活寄生合剂与LDH 两者的交集靶标为50 个，见图1B。

图1 加味独活寄生汤中有效活性成分分布情况及药物－疾病靶标交集情况

3.1.2 加味独活寄生合剂干预LDH 的“药物－化合物－疾病靶标”网络模型的构建 将交集靶标入Cytoscape 软件中构建“药物－化合物－疾病靶标”网络图，见图2。 其中节点的类型代表药物成分、疾病和交集靶标，利用“CentiScape”插件计算有效成分的度值，度值越高提示发挥主要功能的概率越大。 在“药物－化合物－疾病靶标”网络模型中，该网络的度值的中位数为9，大于该值的活性成分有槲皮素、木犀草素、汉黄芩素、山柰酚，提示它们在加味独活寄生合剂干预LDH 中发挥主要功能。

图2 加味独活寄生合剂干预LDH 的“药物－化合物－疾病靶标”网络模型

3.1.3 加味独活寄生合剂干预LDH 的PPI 的构建及核心靶蛋白的获取 将获得的交集靶标输入STRING 数据库，将蛋白种类设置为“Homo sapiens”，将Settings 设为“high confidence：0.7”，其他参数保持默认设置，获得PPI 网络。并导入Cytoscape 软件绘制PPI 网络图并进行网络拓扑分析，根据度值大于中位数筛选出核心靶蛋白，如图3A所示。 此网络的度值中位数为13.4，以此为标准筛选出核心靶蛋白16 个，如图3B 所示，IL-6 靶蛋白的度值最高，提示最可能是加味独活寄生合剂干预LDH 的核心靶点。

图3 加味独活寄生合剂干预LDH 的PPI 网络图及核心靶蛋白

3.1.4 加味独活寄生合剂活性成分-LDH 靶点GO功能及KEGG 通路富集分析 通过clusterProfiler GO.R 插件及Perl 语言对活性成分与LDH 的交集靶标进行GO 分析获取1 294 生物功能、22 条细胞功能以及70 种分子功能，如图4A 所示。 应用clusterProfilerKEGG.R 插件进行KEGG 通路富集分析。 如图4B 所示，KEGG 富集分析中IL-17 相关信号通路富集的集因子值较高，提示其可能为关键通路。

图4 加味独活寄生合剂干预LDH 的GO 功能（A）及KEGG 通路富集（B）分析

3.2 体外实验验证

3.2.1 终板软骨细胞及其退变模型鉴定 倒置显微镜下细胞贴壁生长，细胞形态为梭形并多角形，见图5A。 甲苯胺蓝染色显示，细胞核被染色为蓝色，细胞质及胞浆被染为淡蓝色，见图5B。CollagenⅡ免疫荧光染色鉴定结果显示，胞浆荧光为红色，细胞核不着色，见图5C。 据此可鉴定提取培养的细胞为终板软骨细胞。

图5 终板软骨细胞的鉴定

IL-17 刺激诱导终板软骨细胞24 h 后，倒置显微镜下观察细胞，发现少量漂浮细胞，细胞伪足轻度减少，见图6A。甲苯胺蓝显示，可见细胞有空泡状改变，见图6B。CollagenⅡ免疫荧光染色鉴定结果显示，红色荧光颜色明显变浅，见图6C。由此可以推断，经过IL-17 刺激诱导终板软骨细胞24 h 后，终板软骨细胞明显退变衰老，细胞功能下降。

图6 退变终板软骨细胞模型的鉴定

3.2.2 含药血清毒性检测 与空白对照组相比，含药血清超过20%的各组细胞活性显著下降（P＜0.05），具有显著的细胞毒性，因此，选定最高含药血清浓度为20%。 详见图7。

图7 不同浓度含药血清对终板软骨细胞活性影响

3.2.3 各组终板软骨细胞活性 与空白对照组相比，经过IL-17 干预造模24 h 的终板软骨细胞，活性显著下降（P＜0.05）。与模型对照组相比，加味独活寄生合剂低、中、高剂量组活性显著升高（P＜0.05）。 详见图8。

图8 各组终板软骨细胞活性

3.2.4 各组终板软骨细胞周期 与空白对照组相比，其余各组的G1 期细胞比例显著升高（P＜0.05），S期比例显著降低（P＜0.05），见图9。与模型组相比，加味独活寄生合剂低、中、高剂量组G1 细胞比例均显著降低（P＜0.05），S 期比例显著升高（P＜0.05），见图10。

图9 各组终板软骨细胞周期

图10 各组终板软骨细胞周期比例

3.2.5 各组终板软骨细胞上清液IL-6 的含量的比较 与空白对照组相比，经过IL-17 干预造模24 h的终板软骨细胞，IL-6 含量明显升高（P＜0.05）。 与模型对照组相比，加味独活寄生合剂低、中、高剂量组IL-6 含量显著降低（P＜0.05）。 详见图11。

图11 各组终板软骨细胞上清液IL-6 的含量

3.2.6 各组终板软骨细胞p-p65、MMP9 mRNA 的相对表达量 与空白对照组相比，经过IL-17 干预造模24 h 的终板软骨细胞，p-p65、MMP9 mRNA 的相对表达量明显升高（P＜0.05）。与模型对照组相比，加味独活寄生合剂低、中、高剂量组p-p65 mRNA的相对表达量均显著降低（P＜0.05）。 详见图12。

图12 各组终板软骨细胞p-p65、MMP9mRNA 的相对表达量

3.2.7 各组终板软骨细胞p-p65、MMP9 蛋白的表达 与空白对照组相比，模型对照组p-p65、MMP9蛋白表达明显升高（P＜0.05）。 与模型对照组相比，加味独活寄生合剂低、中、高剂量组p-p65、MMP9蛋白表达均降低（P＜0.05）。 详见表1、图13—14。

表1 各组软骨细胞中p-p65、MMP9 蛋白表达量的变化（±s，n=3）

表1 各组软骨细胞中p-p65、MMP9 蛋白表达量的变化（±s，n=3）

注：与空白对照组相比，*P＜0.05；与模型对照组相比，#P＜0.05。

组别空白对照组模型对照组加味独活寄生合剂低剂量组加味独活寄生合剂中剂量组加味独活寄生合剂高剂量组F P p-p65/GAPDH 0.49±0.02 0.90±0.02*0.79±0.02*#0.76±0.02*#0.58±0.07*#73.133＜0.05 MMP9/GAPDH 0.71±0.02 0.92±0.01*0.88±0.02*#0.83±0.02*#0.61±0.04*#76.406＜0.05

图13 各组终板软骨细胞p-p65 蛋白表达电泳图

图14 各组终板软骨细胞MMP9 蛋白表达电泳图

4 讨论

随着社会人口老龄化和人们生活方式的改变，LDH 的发病率明显增加[15]。由于其高致残率的特点，LDH 给社会和家庭带来了沉重的负担[16-17]，因此，对于LDH 的防治有十分重要的意义。本研究旨在通过网络药理学和体外实验研究，探究加味独活寄生合剂治疗LDH 的具体作用机制。本研究运用网络药理学方法发现加味独活寄生合剂治疗LDH 具有多成分、多靶点、多通路的特征。 槲皮素、木犀草素、汉黄芩素和山柰酚可能是加味独活寄生合剂治疗LDH的主要活性成分， 而IL-6、JUN、AKT-1、MAPK-8 和MMP9 则是其对应的关键靶点。

研究结果提示，加味独活寄生合剂中含有295种活性成分，其中槲皮素、木犀草素、汉黄芩素和山柰酚是治疗LDH 较为重要的活性成分。这4 种成分均属于黄酮类化合物，是植物为抵御外界胁迫而产生的天然化合物，具有较强的抗氧化、抗炎和抗病毒作用[18]。 槲皮素是一种在安全剂量范围内天然无毒的类黄酮，具有抗氧化、抗凋亡和抗炎特性，可以通过抑制氧化应激、减少炎症反应和恢复线粒体功能障碍来延缓软骨细胞衰老[19]。 木犀草素抑制H2O2诱导原代鼠软骨细胞中的细胞死亡、细胞凋亡、氧化应激、程序性坏死和炎症介质产生[20]。汉黄芩素通过诱导软骨细胞中AMPKα 磷酸化，抑制铁死亡，从而保护软骨细胞[21]。 山柰酚可通过抑制炎症、氧化应激、破骨细胞自噬和成骨细胞凋亡，同时激活成骨细胞自噬来实现骨骼保护作用[22]。

炎症的刺激会引起终板软骨细胞的退变继而引发椎间盘的突出[4-5]。 IL-17 能够促进炎症因子和趋化因子的表达，导致各种炎症性疾病的发展。 IL-17通过结合异二聚体受体IL-17RA 和IL-17RC，可诱导NF-κB 等转录基因的表达，增强下游IL-6、MMP9等细胞因子的表达[23-25]；从而促进炎症反应的发生，表达一系列炎症介质，这些介质可以损伤软骨细胞功能、抑制软骨细胞增殖并诱导软骨细胞凋亡，最终造成软骨细胞代谢失衡以及疾病的发生和发展[26]。IL-6 是白细胞介素家族中的一种具有多重效应的细胞因子，参与调控细胞的生长、分化等各方面。 作为炎症发生和参与的重要介质，其能够影响LDH、膝骨性关节炎等骨与关节退行性疾病的发生发展，在腰椎间盘突出组织中存在较高表达[27]。 MMP9 是基质合成和降解的关键调节因子，在生理条件下，MMP9 可水解衰老和受损的椎间盘组织，其过度活化会导致椎间盘的退化并引起疼痛[28]。 此外，NF-κB是一种重要的转录因子，可调节软骨细胞增殖和凋亡相关基因的表达[29]。 相关研究表明，IL-17 与软骨细胞表面的IL-17 受体结合后，可触发NF-κB p65的磷酸化，进而控制软骨正常发育和病理破坏[30]。

本研究中，IL-17 干预后的细胞伪足轻度减少，有空泡状改变，Ⅱ型胶原含量明显减低，形成了明显的终板软骨细胞退变模型。 与空白对照组相比，模型对照组细胞活性显著下降（P＜0.05），增殖明显被抑制（P＜0.05），IL-6、p-p65、MMP9 的表达显著升高（P＜0.05）。通过不同浓度的含药血清干预后，相比于模型对照组细胞，细胞活性显著升高（P＜0.05），增殖情况显著改善（P＜0.05），各组细胞IL-6、p-p65、MMP9的表达明显降低（P＜0.05）。

综上所述，加味独活寄生合剂含药血清可起到保护终板软骨细胞退变的作用。 其可能通过调控IL-17/NF-κB 通路，抑制IL-6 以及MMP9 的表达，促进终板软骨细胞的增殖，从而发挥对LDH 的治疗作用。 然而，本研究仍存在不足之处，实验只验证了核心通路和对应的核心靶点，实验未设置阳性药物对照组。未能完整验证网络药理学提示的其他通路及蛋白；接下来课题组将进行更加深入的动物实验和细胞实验，以进一步探究加味独活寄生合剂治疗LDH 的作用机制，为其临床应用提供更加坚实的理论依据。