宰后成熟过程中线粒体损伤与滩羊肉嫩度的关联性分析

李 荣，罗瑞明，杜 瑞，罗玉龙,*，王金霞，陈雪妍，张 倩

（1.宁夏大学食品科学与工程学院，宁夏 银川 750021；2.银川市农产品质量检测中心，宁夏 银川 750000）

畜禽屠宰放血后，线粒体仍然具有一定活性，但是当外部环境改变时，由于缺乏氧气和养分供给，细胞内氧化稳态被打破，活性氧（reactive oxygen species，ROS）大量累积，造成肌细胞的损伤[1]。线粒体作为细胞“能量工厂”，是ROS产生的主要场所，也最易受损伤。随着宰后成熟时间的延长，肌细胞线粒体会逐渐发生氧化损伤，并呈现出细胞色素c（cytochrome c，Cyt-c）释放、线粒体膜电位下降、线粒体膜通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）开放等线粒体损伤特点。Wang Linlin[2]和Zhang Jiaying[3]等研究发现线粒体损伤与嫩度之间有显著相关性，并随着宰后成熟时间的延长，线粒体损伤逐渐加剧，嫩度则逐渐改善。有研究发现线粒体中一些蛋白质含量与宰后肌肉嫩度显著相关。Lavile等[4]发现宰后牛肉线粒体内、外膜蛋白的变化与嫩度变化之间具有显著相关性。Malheiros等[5]通过蛋白质组学技术对不同嫩度的牛肉进行研究发现，线粒体损伤程度越高的牛肉嫩度也越好。魏起超[6]通过研究不同部位牛肉线粒体损伤与嫩度的关联性，发现粒体损伤与嫩化同时发生，且线粒体损伤程度与嫩度成正比，损伤越严重，嫩度越好。综上，宰后早期线粒体损伤与嫩度之间存在显著相关性，宰后线粒体损伤可能是调控肌肉嫩度的一条重要途径[7]。

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，可以和TLR4基因编码的跨膜蛋白Toll 样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）结合。LPS通过TLR4干扰核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）的激活，激活后的NF-κB分泌促炎症细胞因子，从而介导炎症发生，诱导细胞凋亡[8]。张钊等[9]发现LPS刺激可以改变线粒体的形态，导致细胞线粒体膜电位下降，促进ROS的产生，诱导细胞凋亡。Gogvadze等[10]的研究表明，从线粒体内膜释放的各种促凋亡蛋白在胞浆中介导凋亡发生，即线粒体对调控细胞凋亡的发生有着至关重要的作用。以上研究结果均表明，LPS刺激可诱导线粒体形态发生改变，从而造成线粒体损伤。因此，可以通过LPS诱导线粒体损伤的发生，探究宰后成熟过程中线粒体损伤对滩羊肉嫩度的影响。

本实验以滩羊背最长肌（M. Longissimus dorsi）为研究对象，通过LPS诱导线粒体损伤测定其在分别成熟0、6、12、24、72 h过程中的pH值、蒸煮损失率、质构特性、水分分布、剪切力和肌原纤维小片化指数（myofibril fragmentation index，MFI）以及肌细胞线粒体ROS含量、膜电位、MPTP开放程度和肿胀情况，以此阐释滩羊肉成熟过程中线粒体损伤与滩羊肉嫩度之间的关联性，为后续揭示宰后肌肉嫩度的改善机制提供思路，并为滩羊肉成熟期间肉品质量控制技术研发提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

滩羊背最长肌购自宁夏盐池县宁鑫肉业有限公司，选取胴体质量相近的6 月龄公滩羊9 只，宰前遵循动物管理规定，屠宰后立即用灭菌刀取下右侧背最长肌，剔除可见脂肪与结缔组织后，置于聚乙稀薄膜内，用锡纸包装后置于带有编号的保鲜袋中，贮存在4 ℃条件下，分别在成熟0、6、12、24、72 h时检测指标。

LPS、甘露醇、Hepes、蔗糖、硫酸铁、VC 北京索莱宝生物科技有限公司；磷酸氢二钠、氯化镁、叠氮化钠、乙二胺四乙酸、Tris-HCl缓冲液、氯化钾（均为分析纯）国药集团化学试剂有限公司；2’,7’-二氢二氯荧光素二乙酸酯 美国MCE公司；总蛋白定量测定试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

SJ-3F便携式pH计 上海德图仪器国际贸易有限公司；TA-XT plus12587质构分析仪 英国Stable Micro Systems公司；752N紫外分光光度计 上海仪电科学仪器股份有限公司；F-4700荧光分光光度计 上海元析仪器有限公司；HZB-12/A家用制冰机 宁波惠康国际工业有限公司；TGL-16D冷冻高速离心机 常州中捷实验仪器制造有限公司；JX-CL冷冻研磨仪 上海净信实验设备有限公司；HHS-21-6电热恒温水浴锅 上海四蓝仪器设备有限公司；EL×800酶标仪 美国Biotek公司。

1.3 方法

1.3.1 样品采集

屠宰后立即取下背最长肌，迅速去除表面脂肪及筋膜，分割成100 g左右肉样，快速存入液氮作为0 h样品。剩下的肉样切成100 g左右大小一致的肉块，随机分为2 组，第1组不作处理，为空白对照组，第二组注射30 mg/L LPS溶液（肉样和处理液的比例为1∶1），装入密闭自封袋，在4 ℃条件下分别成熟0、6、12、24、72 h，并在对应时间节点测定pH值、蒸煮损失率、剪切力等指标，对线粒体损伤等不便立即测定的指标，在相应的时间节点取样，用液氮快速冻结，置于－80 ℃冷冻待测。

1.3.2 线粒体蛋白的提取

参照赵亚亚[11]的方法并稍作修改。取滩羊背最长肌2 g肉样，剪碎后置于20 mL线粒体分离介质中，用低温研磨仪匀浆（10 000×g，2 min），匀浆液离心（4 ℃、1 000×g，10 min）后取上清液进一步离心（4 ℃、1 000×g，10 min），随后取上清液再次离心（4 ℃、8 000×g，20 min），弃上清液所得沉淀即为线粒体，用BCA法测定蛋白质量浓度。

1.3.3 线粒体膜电位测定

按照线粒体膜电位检测试剂盒说明书测定线粒体膜电位。

1.3.4 MPTP开放程度测定

参照王琳琳[12]的方法，用3 mL MPTP测试介质（230 mmol/L甘露醇、70 mmol/L蔗糖、3.0 mmol/L Hepes，pH 7.4）将纯化的线粒体蛋白质量浓度调至0.3 mg/mL，取1 mL定量好的线粒体悬液（0.3 mg/mL）与3 mL MPTP测试介质混匀后，在540 nm波长处测定吸光度，以吸光度表征MPTP开放程度，吸光度越大MPTP开放程度越小。

1.3.5 线粒体肿胀程度测定

参照张佳莹[13]的方法，取3 mL 0.5 mg/mL线粒体蛋白与0.4 mL 0.5 mmol/L FeSO4、0.4 mL 0.5 mmol/L VC于37 ℃孵育15 min，在520 nm波长处测定吸光度，以吸光度表征线粒体肿胀程度。

1.3.6 线粒体ROS水平测定

参照Zhu Zhendong等[14]的方法并稍作修改。取2 g肌肉样品加入8 mL预冷磷酸缓冲液（50 mmol/L，pH 7.4），用低温研磨仪匀浆（10 000×g，2 min）。匀浆于3 000×g、4 ℃条件下离心15 min，并收集上清液，采用双缩脲法测定上清液蛋白质量浓度。ROS荧光强度测定：上清液与等体积的反应缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl、0.8 g/L NaCl、0.1 mmol/L乙二胺四乙酸二钠、10 mmol/L蔗糖、10 μmol/L 2’,7’-二氢二氯荧光素二乙酸酯试剂，pH 7.4）在酶标板内迅速混合，利用荧光酶标仪于激发波长480 nm、发射波长525 nm处立即测定孵育前的荧光强度，置于37 ℃孵育箱内孵育30 min后再次测定孵育后荧光强度，ROS的相对含量按式（1）计算。

1.3.7 pH值测定

剔除样品可见脂肪与结缔组织，使用便携式pH计测定成熟期间肌肉pH值。

1.3.8 蒸煮损失率的测定

参照侯艳茹[15]的方法并稍作修改。称取约40 g的肉块，剔除表面筋膜和脂肪，记为m0，置于蒸煮袋中，在85 ℃的水浴锅中煮40 min取出，待肉块冷却后，用滤纸吸干表面水分，再次称量记为m1，按式（2）计算蒸煮损失率。

1.3.9 质构特性分析

根据毕永昭[16]的方法并稍作修改，取上述1.3.8节中蒸煮后的肉样，顺着肌纤维方向切成1 cm×1 cm×2 cm大小肉条。在TPA模式下测定肉样质构特性，进行3 次平行试验。将肉样放置于TPA平板上，对其进行两次压缩测试，选用P/50探头，压缩距离10 mm，触发力5 g，间隔时间5 s，测前、测中和测后速率分别为2.0、1.0 mm/s和1.0 mm/s，探头放置方向与肌纤维平行，用TPA-macro软件进行分析。

1.3.10 水分分布的测定

参照单启梅[17]的方法并稍作修改。选择CPMG脉冲序列，根据CPMG指数衰减曲线图，用分析软件进行迭代反演得到横向弛豫时间T2图谱。

1.3.11 剪切力的测定

参照Bai Shuang等[18]的方法并稍作修改，取上述1.3.8节中蒸煮后的肉样，顺着肌纤维方向切成1 cm×1 cm×2.5 cm大小肉条，进行3 次平行试验。选用HDP/BSW探头，距离30 mm，触发力20 g，测前、测中和测后速率分别为2.0、2.0 mm/s和10.0 mm/s，探头放置方向与肌纤维垂直。

1.3.12 肌原纤维小片化指数的测定

参照王琳琳[12]的方法并稍作修改。2.00 g肉样中加入8 mL预冷的缓冲溶液（100 mmol/L KCl、20 mmol/L K3PO4、1 mmol/L乙二胺四乙酸、1 mmol/L MgCl2、1 mmol/L NaN3，pH 7.1），匀浆60 s后弃去上清液，再以8 000×g离心20 min，离心两次。将沉淀物与缓冲溶液混合，使蛋白终质量浓度为0.5 mg/mL。使用酶标仪在540 nm波长处检测吸光度，MFI以吸光度乘以200表示。

1.4 数据处理与分析

每个指标重复测定3 次，结果以平均值±标准差表示。采用Excel软件统计数据；采用SPSS Statistics 26软件对数据进行方差分析，以P＜0.05表示差异显著；采用Origin 2021软件作图；采用R软件进行相关性分析（Pearson法）。

2 结果与分析

2.1 滩羊肉宰后成熟过程中ROS水平的变化

ROS可通过诱导线粒体氧化损伤调控细胞凋亡[19]。滩羊宰后成熟过程中，对照组和LPS组滩羊肉肌细胞线粒体ROS水平变化如图1所示，在宰后0～72 h，ROS相对含量整体呈现显著上升趋势（P＜0.05）；值得注意的是，LPS处理组的ROS水平在成熟期内始终显著高于对照组（P＜0.05）。

图1 宰后滩羊肉成熟过程中ROS水平的变化Fig. 1 Changes in ROS during postmortem aging of Tan sheep meat

2.2 滩羊肉宰后成熟过程中MPTP开放程度的变化

膜通透性改变和膜电位丧失是线粒体膜损伤的显著标志，是细胞凋亡早期的必不可少的过程[20]。如图2所示，宰后0～72 h，吸光度显著下降，表明MPTP开放程度显著增大（P＜0.05），这可能是宰后肌细胞线粒体的损伤程度加剧，使MPTP呈不可逆的开放状态；在成熟过程中，LPS处理组的MPTP开放程度显著高于对照组（P＜0.05），说明LPS处理可能加快了MPTP的不可逆开放。

图2 滩羊肉成熟过程中MPTP开放程度的变化Fig. 2 Changes in MPTP opening during postmortem aging of Tan sheep meat

2.3 滩羊肉宰后成熟过程中线粒体膜电位的变化

线粒体膜电位与线粒体膜通透性密切相关，并且受到MPTP的调节[12]。由图3可知，宰后线粒体膜电位整体呈现显著下降趋势（P＜0.05）；在成熟过程中，LPS处理组的线粒体膜电位始终低于对照组，表明LPS明显促进了线粒体膜电位的下降。

图3 滩羊肉成熟过程中膜电位的变化Fig. 3 Changes in in membrane potential during postmortem aging of Tan sheep meat

2.4 滩羊肉宰后成熟过程中线粒体肿胀的变化

线粒体肿胀程度用吸光度来表示，透过线粒体的光越多吸光度越低，表明线粒体肿胀越明显[13]。由图4可知，在宰后0～72 h，吸光度整体显著下降（P＜0.05），说明线粒体肿胀程度显著增加；在24 h时，LPS处理组的线粒体肿胀程度显著低于对照组（P＜0.05），其余成熟时间两组差异不显著（P＞0.05）。

图4 滩羊肉成熟过程中线粒体肿胀程度的变化Fig. 4 Changes in mitochondrial swelling during postmortem aging of Tan sheep meat

2.5 滩羊肉宰后成熟过程中pH值的变化

pH值是衡量宰后初期肌肉品质的重要指标之一，其下降会造成内环境的酸化，从而影响肌肉保水性[21]。由图5可以得出，宰后0～72 h内，对照组滩羊肉的pH值显著下降（P＜0.05）；而LPS处理组在0～24 h内呈现显著下降趋势（P＜0.05），并在24 h达到极限pH值，随后开始上升。在成熟12～24 h内，LPS处理组的pH值显著高于LPS对照组（P＜0.05）。Tao Yingmei[22]及姬琛[23]等也通过研究发现宰后成熟期间滩羊pH值变化范围为5.4～6.3，这与本实验研究结果一致。

图5 滩羊宰后成熟过程中pH值的变化Fig. 5 Changes in pH during postmortem aging of Tan sheep meat

2.6 滩羊肉宰后成熟过程中蒸煮损失率的变化

蒸煮损失率是表征加热过程中肌肉蛋白质变性、水分损失的重要指标。蒸煮损失率越低，系水力越高，保水性能越好[11]。如图6所示，宰后0～72 h内，对照组滩羊肉的蒸煮损失率呈现整体显著上升的趋势（P＜0.05）；而LPS处理组在0～24 h呈现显著上升趋势（P＜0.05），24～72 h呈现显著下降趋势（P＜0.05）。在宰后成熟12 h和24 h，LPS处理组相较于处理组显著上升（P＜0.05）。

图6 滩羊宰后成熟期间蒸煮损失率的变化Fig. 6 Changes in cooking loss during postmortem aging of Tan sheep meat

2.7 滩羊肉宰后成熟过程中质构特性的变化

由表1可知，宰后不同处理组的滩羊肉硬度呈先升后降的趋势，0～24 h内，LPS处理组的硬度显著升高（P＜0.05），在24 h达到最高值后开始下降；宰后6 h，对照组硬度高于LPS处理组，12～72 h LPS处理组的硬度开始高于对照组。宰后不同处理组滩羊肉的咀嚼性呈现先升后降趋势，0～12 h内，对照组咀嚼性呈现上升趋势，在宰后12 h达到最高值，12～72 h显著降低（P＜0.05），LPS处理组的下降较对照组略早。宰后不同处理组滩羊肉的内聚性呈先升后降趋势，0～12 h内，不同处理组的咀嚼性均显著升高（P＜0.05），12 h达到最高值。24～72 h内均显著降低（P＜0.05），LPS处理组与对照组间的变化不明显（P＞0.05）。宰后不同处理组滩羊肉的弹性呈下降趋势，0～24 h内，不同处理组的弹性显著降低（P＜0.05），LPS处理组与对照组差异不显著（P＞0.05）。

表1 宰后成熟过程中滩羊肉质构特性的变化Table 1 Changes in texture parameters during postmortem aging of Tan sheep meat

2.8 滩羊肉宰后成熟过程中水分分布的变化

如图7所示，不同成熟时间的滩羊肉在横向弛豫时间T2图谱上都有3 个特征峰，第一个峰的弛豫时间在0.1～10 ms（T21），T21代表结合水；第二个峰的弛豫时间在10～100 ms（T22），T22代表不易流动水；第三个峰的弛豫时间在100～1 000 ms（T23），T23代表位于肌原纤维之间的自由水。T22峰值最高，这是由于不易流动水被困在肌纤维内网络中，这意味着滩羊肉中的水分大多以不易流动水的形式存在，随着成熟时间的延长T22峰值变化最明显且呈现缩小趋势，其中LPS处理组的缩小趋势明显高于对照组，说明其保水性较差。

图7 滩羊宰后成熟期间水分弛豫时间变化Fig. 7 Changes in water transverse relaxation time during postmortem aging of Tan sheep meat

宰后滩羊肉成熟过程中的弛豫时间T2的变化如图8所示，随着成熟时间延长，横向弛豫时间T21无明显变化，表明结合水不受成熟时间的影响，T22呈下降趋势，T23的下降趋势较为明显，不易流动水和自由水弛豫时间明显缩短，表明流失的水分主要是自由水和不易流动水。

图8 滩羊宰后成熟期间弛豫时间T2的变化Fig. 8 Changes in relaxation time T2 during postmortem aging of Tan sheep meat

2.9 滩羊肉宰后成熟过程中嫩度的变化

嫩度是衡量肉品质量的重要参数，通常用剪切力来表征。剪切力越小，则嫩度越大。由图9可知，在宰后0～72 h，滩羊肉的剪切力整体呈下降趋势，其中6～72 h内LPS处理组显著下降（P＜0.05）；对照组在6～24 h内显著下降（P＜0.05），其余成熟时间变化不显著（P＞0.05）。在宰后同一成熟时间，6 h的LPS处理组剪切力高于对照组，差异不显著（P＜0.05），12、24 h和72 h的LPS处理组剪切力显著低于对照组（P＜0.05）。

图9 宰后滩羊肉成熟过程中剪切力的变化Fig. 9 Changes in shear force during postmortem aging of Tan sheep meat

2.10 滩羊肉宰后成熟过程中MFI的变化

MFI是表征肌原纤维完整性和肉嫩度的重要参数[24]。由图10可知，在宰后成熟过程中，滩羊肉的MFI整体呈现显著上升趋势（P＜0.05），表明肌原纤维蛋白降解程度较高；LPS处理组的上升趋势显著高于对照组（P＜0.05），72 h LPS处理组的MFI是0 h的3.35 倍，表明LPS处理促进了肌纤维蛋白的降解。

2.11 线粒体损伤与滩羊肉嫩度的相关性分析

滩羊宰后成熟期间线粒体损伤与嫩度指标变化之间的Pearson相关性分析如图11所示。线粒体膜电位与MPTP开放程度、线粒体肿胀程度、pH值、剪切力、MFI呈现极显著正相关性（P＜0.01），与T2弛豫时间呈现显著正相关性（P＜0.05），与ROS相对含量、蒸煮损失率呈现极显著负相关性（P＜0.01）；MPTP开放程度与线粒体肿胀程度、pH值、剪切力、MFI呈现极显著正相关性（P＜0.01），与T2弛豫时间呈现显著正相关性（P＜0.05），与ROS相对含量、蒸煮损失率呈现极显著负相关性（P＜0.01）；线粒体肿胀程度与pH值、剪切力、MFI呈现极显著正相关性（P＜0.01），与ROS相对含量、蒸煮损失率呈现极显著负相关性（P＜0.01）；ROS相对含量与蒸煮损失率呈现极显著正相关性（P＜0.01），与pH值、剪切力、MFI呈现极显著负相关性（P＜0.01），与T2弛豫时间呈现显著负相关性（P＜0.05）；pH值与剪切力呈现极显著正相关性（P＜0.01），与MFI呈现显著正相关性（P＜0.05）；与蒸煮损失率呈现显著负相关性（P＜0.05）；T2弛豫时间与MFI呈现显著正相关性（P＜0.05），与蒸煮损失率呈现显著负相关性（P＜0.05）；蒸煮损失率与剪切力、MFI呈现极显著负相关（P＜0.01）；剪切力与MFI呈现显著正相关（P＜0.05）。

图11 宰后滩羊肉成熟过程中线粒体损伤与嫩度的相关性分析热图Fig. 11 Heatmap for correlation between mitochondrial damage and tenderness during postmortem aging of Tan sheep meat

相关性分析结果表明线粒体膜电位、线粒体肿胀程度、MPTP开放程度、ROS相对含量与pH值、T2弛豫时间、蒸煮损失率、剪切力、MFI之间存在显著的相关性，即线粒体损伤程度与嫩度指标呈现正相关，表明随着线粒体损伤的加剧，嫩度提升。魏起超[6]通过研究不同部位牛肉线粒体损伤与嫩度的关联性，发现粒体损伤与嫩化同时发生，且线粒体损伤越严重，嫩度越好。

3 讨 论

MPTP的低通透性开放对维持线粒体和细胞的正常生理功能是不可或缺的，而高通透性的MPTP开放则会引起线粒体膜电位的降低、ATP耗竭、线粒体膜通透性增加等一系列线粒体结构变化[25-26]。在本研究中，ROS水平呈现上升趋势，MPTP开放程度逐渐增大，线粒体膜电位持续降低。这可能是LPS处理使得ROS水平不断升高，ROS可能通过诱导MPTP的开放和线粒体膜电位的下降造成线粒体损伤。

本研究中肌肉pH值下降并达到极限pH值，蒸煮损失率呈现上升趋势。这可能是由于宰后内环境改变切断了与外界的联系，有氧呼吸转变为糖酵解生成乳酸使机体pH值降低，肌肉蛋白质的净电荷数量也随之减少，因此蛋白质之间的排斥力也随之减弱，使蛋白质间的空隙变小并将间隙间的水分挤出，造成肌肉的失水率增加，保水性变差[27]。宰后滩羊肉的硬度、咀嚼性、内聚性均呈先升后降趋势，弹性整体呈现下降趋势，这与孙志昶[28]的研究结果一致。可能是宰后缺血缺氧环境的会产生大量乳酸，导致pH值降低至蛋白质等电点，相关蛋白质发生变性，使滩羊肉的咀嚼性和内聚性升高。嫩度是影响消费者满意程度重要因素，常用剪切力来表示嫩度[29]。MFI可以体现肌肉细胞内部肌原纤维降解程度和骨架蛋白的破坏程度，MFI越大，说明原结构破坏越严重，肌肉的嫩度越高[31]。故剪切力和MFI是表征肌肉嫩度的重要指标。Kriese等[31]证实了鸡肉剪切力降低的同时嫩度有所提升。孙志昶[28]研究发现宰后不同部位牦牛肉的MFI总体呈现上升趋势，牦牛肉嫩度也有所提升。这与本研究结果一致，表明宰后成熟过程中滩羊肉嫩度改善。即宰后成熟过程中肌原纤维的结构改变缩短了肌肉蛋白分子间隙，造成肌肉的失水率增加保水性变差，促进肌原纤维小片化进程，导致滩羊肉嫩度改善。

4 结 论

宰后成熟过程中，LPS处理组和空白组MPTP持续开放；ROS相对含量、蒸煮损失率、MFI呈现上升趋势；线粒体膜电位、pH值、弹性、T22峰面积、剪切力呈现下降趋势；硬度、咀嚼性和内聚性呈先升后降趋势。结果表明，宰后肌细胞内氧化稳态打破，造成ROS含量上升，进而通过诱导MPTP的开放和线粒体膜电位的下降造成线粒体损伤，而LPS处理加重了这一结果；同时存在肌原纤维的结构改变从而缩短肌肉蛋白分子间隙，造成肌肉的失水率增加和保水性变差，促进肌原纤维小片化进程，导致滩羊肉嫩度改善。结合相关性分析可知，滩羊宰后成熟过程中线粒体损伤与嫩化同时发生，且线粒体损伤越严重，嫩度越好。