H5蓝莓组培快繁技术研究

王 岩，陈新华

（沈阳市农业科学院，辽宁 沈阳 110034）

蓝莓为杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（VacciniumSPP.）落叶灌木，果实色泽呈蓝紫色，因其果肉细腻，味道酸甜适度，香气宜人而深受大众喜爱。蓝莓中富含花青素，不仅具有很强的抗氧化抗衰老活性，同时对高血压、高血脂等疾病具有显著的预防与抑制作用。我国自20 世纪80 年代引入蓝莓栽培品种以来，经过40 年的发展，蓝莓产业呈现供需两旺的健康发展态势。辽宁省处于寒温地区，具有发展蓝莓产业得天独厚的优势，2020 年辽宁省蓝莓栽培面积已达7 800 hm2［1］。传统的蓝莓栽培以露天栽培为主，栽培品种常选用耐寒性强的晚熟品种。随着人民生活水平的提高，蓝莓鲜果反季节需求持续增加，筛选和推广蓄冷量低的早熟品种，通过设施栽培实现鲜果提前上市成为蓝莓产业发展新趋势［2］。

H5 蓝莓为南高丛品种，具有生长旺盛，枝干微开张，分枝多冠幅大，早挂果产量高，果实大口感好等优点；而且H5 蓝莓需冷量仅需50 h，休眠时间短，是适合设施化反季节栽培的极早熟品种。以H5蓝莓为研究材料，从外植体消毒、基础培养基选择、激素种类和配比等因素对腋芽萌发、丛生芽诱导、不定根分化等方面进行研究，为H5 蓝莓组织培养技术提供技术支持［3-4］。

1 研究材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为H5 蓝莓当年生半木质化枝条，要求枝条生长健壮、无病虫害。

1.2 试验方法

1.2.1 不同消毒剂组合对外植体消毒效果的影响

将半木质化的当年生枝条剪成2 cm 的茎段，每个茎段带有1 个腋芽，先用中性洗衣液溶液浸泡约5 min，并用软毛刷清洗外植体表面污渍，流水冲洗25～30 min。外植体分别用75%酒精消毒30 s 或1%次氯酸钠消毒10 min，然后用0.1%升汞溶液浸泡消毒一定的时间，并用无菌水冲洗5 次。将消毒后的外植体两端分别切除0.2 cm，接种于MS 培养基中，每瓶接种外植体1 个，每个处理重复3 次，每个重复接种20 瓶。在25 ℃，光照强度2 500 lx，光照时间16 h/d 的条件下培养30 d 后，统计污染率、成活率［5-6］。

1.2.2 不同pH 值对H5 蓝莓外植体腋芽增殖倍数的影响

配制MS 为基础培养基，pH 值分别调至5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0，添加0.2 mg/L 吲哚乙酸（IAA）和2 mg/L 玉米素（ZT）。将消毒后的外植体分别接种于不同pH 值的基础培养基中，每个处理重复3 次，每个重复接种20 瓶。在温度25 ℃、光照强度2 500 lx、光照时间16 h/d 的条件下培养60 d后，统计分枝数和腋芽数［7-8］。

1.2.3 基础培养基对H5蓝莓腋芽增殖倍数的影响

配制MS、1/2 MS、White、B5、改良WPM 5 种基础培养基，将pH 值调至5.4，添加0.2 mg/L 吲哚乙酸（IAA）和2 mg/L 玉米素（ZT）。将消毒后的外植体接种于不同的基础培养基中，每个处理应重复3 次，每个重复应接种20 瓶。在温度为25 ℃、光照强度为2 500 lx、光照时间为16 h/d 的条件下培养60 d后，统计分枝数和腋芽数［9］。

1.2.4 不同玉米素浓度对H5 蓝莓丛生芽诱导率的影响

以改良WPM 为基础培养基，pH 值调至5.4，添加0.2 mg/L 吲哚乙酸（IAA）和一定浓度的玉米素（ZT）。将继代培养蓝莓幼苗切成小段，每段带有1 个腋芽，将带有腋芽的茎段接种于不同浓度的玉米素（ZT）培养基中，每个处理重复3 次，每个重复接种20 瓶，每瓶接种10 段。培养60 d 后，统计丛生芽诱导率［10-11］。

1.2.5 数据处理与分析

2 结果与分析

2.1 不同消毒剂组合对外植体消毒效果的影响

不同消毒剂组合对外植体消毒效果的影响见表1。不同消毒剂组合和消毒时间对外植体消毒效果影响显著，随着消毒时间的延长，污染率显著下降，同时腋芽的活力也显著下降。综合分析外植体的污染率和成活率，0.1%升汞消毒9 min 效果最好，消毒时间较短会导致污染率较高，消毒时间过长导致腋芽活性下降，成活率较低。与75%酒精消毒30 s 相比，1%次氯酸钠消毒10 min 的效果更好。1%次氯酸钠消毒10 min+0.1%升汞消毒9 min的效果最佳，污染率为6.67%，成活率为85.00%。

表1 不同消毒剂组合对外植体消毒效果的影响

2.2 不同pH 值对H5 蓝莓外植体腋芽增殖倍数的影响

不同pH 值对H5 蓝莓外植体腋芽增殖倍数的影响如表2 所示。不同pH 值对H5 蓝莓的分枝数量、分枝高度和腋芽数均有显著影响，当pH 值为5.4 时，每个外植体的分枝数和每个分枝的腋芽数最多，分别达到4.58、6.45 个，其腋芽增殖倍数达到29.54 倍。

表2 不同pH值对外植体腋芽诱导率的影响

2.3 不同基础培养基对H5蓝莓腋芽增殖倍数的影响

不同基础培养基对H5 蓝莓分枝数和腋芽增殖倍数的影响较大，结果见表3。其中1/2 MS 和改良WPM 培养基对丛生芽诱导效果较好，每个外植体平均分枝数分别达到5.24、5.98 个，但是由于1/2 MS培养基营养相对缺乏，影响分枝正常生长，平均株高只有3.76 cm，分枝的平均腋芽只有4.21 个，在改良WPM 培养基中，每个分枝平均腋芽数达6.91 个，腋芽增殖倍数达41.32 倍。因此改良WPM 培养基适于作为H5 蓝莓腋芽增殖培养的培养基。

表3 基础培养基对H5蓝莓腋芽增殖倍数的影响

2.4 不同玉米素（ZT）浓度对H5 蓝莓丛生芽诱导率的影响

不同玉米素（ZT）浓度对H5 蓝莓分枝数和腋芽增殖倍数影响显著，结果见表4。由表4 可知，在生长素浓度一定的情况下，随着玉米素（ZT）浓度的增加，对丛生芽的分化具有显著促进作用，当玉米素浓度达到2.5 mg/L 时，分枝数量达到最多，每个外植体分化形成6.14 个分枝；玉米素（ZT）浓度继续升高，分枝数不升反降。此外，玉米素（ZT）浓度对分枝的伸长和腋芽分化也有显著影响，当玉米素（ZT）浓度达到2.0 mg/L 时，分枝平均腋芽数最多，达6.91 个，其腋芽增殖倍数也最高，达41.32 倍。

表4 不同玉米素浓度对H5蓝莓丛生芽诱导率的影响

3 讨论

合适的消毒剂组合和消毒时间是建立植物无菌系的关键。不同植物、不同组织、不同成熟度的外植体，携带微生物的种类、数量不同，对消毒剂的敏感性也不同。本研究选用当年生半木质化的健康枝条作为外植体，与成熟木质化枝条相比对消毒剂更加敏感。结果表明，H5 蓝莓外植体采用1%次氯酸钠消毒10 min+0.1%升汞消毒9 min 时，消毒效果最佳，污染率为6.67%，成活率为85.00%。这与李军萍等（2011）［12］提出的奥尼尔蓝莓外植体最佳消毒方式基本一致。

不同的基础培养基其无机离子、有机物质的组成和浓度存在较大差异［13］。结果表明，1/2 MS 培养基相比于MS 培养基更适合蓝莓生长，这可能是因为蓝莓对氮、磷、钾、钙、镁等大量元素需求较少，微量元素浓度高时反而不利于蓝莓生长。改良WPM培养基中氮、磷、钾等大量元素浓度介于MS 和1/2 MS 培养基之间，既能满足蓝莓生长对各营养素的需求，又避免了离子浓度过高产生的抑制作用［14-15］。

4 结论

本研究结果表明，以当年生半木质化枝条为外植体时，1%次氯酸钠消毒10 min+0.1%升汞消毒9 min 有利于建立H5 蓝莓无菌系。以改良WPM 作为基础培养基，pH 值为5.4，添加0.2 mg/L 吲哚乙酸（IAA）和2.0 mg/L 玉米素（ZT）时，对丛生芽的诱导和腋芽增殖最有利，培养60 d，腋芽增殖倍数达41.32 倍。