王 岩,陈新华
(沈阳市农业科学院,辽宁 沈阳 110034)
蓝莓为杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(VacciniumSPP.)落叶灌木,果实色泽呈蓝紫色,因其果肉细腻,味道酸甜适度,香气宜人而深受大众喜爱。蓝莓中富含花青素,不仅具有很强的抗氧化抗衰老活性,同时对高血压、高血脂等疾病具有显著的预防与抑制作用。我国自20 世纪80 年代引入蓝莓栽培品种以来,经过40 年的发展,蓝莓产业呈现供需两旺的健康发展态势。辽宁省处于寒温地区,具有发展蓝莓产业得天独厚的优势,2020 年辽宁省蓝莓栽培面积已达7 800 hm2[1]。传统的蓝莓栽培以露天栽培为主,栽培品种常选用耐寒性强的晚熟品种。随着人民生活水平的提高,蓝莓鲜果反季节需求持续增加,筛选和推广蓄冷量低的早熟品种,通过设施栽培实现鲜果提前上市成为蓝莓产业发展新趋势[2]。
H5 蓝莓为南高丛品种,具有生长旺盛,枝干微开张,分枝多冠幅大,早挂果产量高,果实大口感好等优点;而且H5 蓝莓需冷量仅需50 h,休眠时间短,是适合设施化反季节栽培的极早熟品种。以H5蓝莓为研究材料,从外植体消毒、基础培养基选择、激素种类和配比等因素对腋芽萌发、丛生芽诱导、不定根分化等方面进行研究,为H5 蓝莓组织培养技术提供技术支持[3-4]。
供试材料为H5 蓝莓当年生半木质化枝条,要求枝条生长健壮、无病虫害。
1.2.1 不同消毒剂组合对外植体消毒效果的影响
将半木质化的当年生枝条剪成2 cm 的茎段,每个茎段带有1 个腋芽,先用中性洗衣液溶液浸泡约5 min,并用软毛刷清洗外植体表面污渍,流水冲洗25~30 min。外植体分别用75%酒精消毒30 s 或1%次氯酸钠消毒10 min,然后用0.1%升汞溶液浸泡消毒一定的时间,并用无菌水冲洗5 次。将消毒后的外植体两端分别切除0.2 cm,接种于MS 培养基中,每瓶接种外植体1 个,每个处理重复3 次,每个重复接种20 瓶。在25 ℃,光照强度2 500 lx,光照时间16 h/d 的条件下培养30 d 后,统计污染率、成活率[5-6]。
1.2.2 不同pH 值对H5 蓝莓外植体腋芽增殖倍数的影响
配制MS 为基础培养基,pH 值分别调至5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0,添加0.2 mg/L 吲哚乙酸(IAA)和2 mg/L 玉米素(ZT)。将消毒后的外植体分别接种于不同pH 值的基础培养基中,每个处理重复3 次,每个重复接种20 瓶。在温度25 ℃、光照强度2 500 lx、光照时间16 h/d 的条件下培养60 d后,统计分枝数和腋芽数[7-8]。
1.2.3 基础培养基对H5蓝莓腋芽增殖倍数的影响
配制MS、1/2 MS、White、B5、改良WPM 5 种基础培养基,将pH 值调至5.4,添加0.2 mg/L 吲哚乙酸(IAA)和2 mg/L 玉米素(ZT)。将消毒后的外植体接种于不同的基础培养基中,每个处理应重复3 次,每个重复应接种20 瓶。在温度为25 ℃、光照强度为2 500 lx、光照时间为16 h/d 的条件下培养60 d后,统计分枝数和腋芽数[9]。
1.2.4 不同玉米素浓度对H5 蓝莓丛生芽诱导率的影响
以改良WPM 为基础培养基,pH 值调至5.4,添加0.2 mg/L 吲哚乙酸(IAA)和一定浓度的玉米素(ZT)。将继代培养蓝莓幼苗切成小段,每段带有1 个腋芽,将带有腋芽的茎段接种于不同浓度的玉米素(ZT)培养基中,每个处理重复3 次,每个重复接种20 瓶,每瓶接种10 段。培养60 d 后,统计丛生芽诱导率[10-11]。
1.2.5 数据处理与分析
不同消毒剂组合对外植体消毒效果的影响见表1。不同消毒剂组合和消毒时间对外植体消毒效果影响显著,随着消毒时间的延长,污染率显著下降,同时腋芽的活力也显著下降。综合分析外植体的污染率和成活率,0.1%升汞消毒9 min 效果最好,消毒时间较短会导致污染率较高,消毒时间过长导致腋芽活性下降,成活率较低。与75%酒精消毒30 s 相比,1%次氯酸钠消毒10 min 的效果更好。1%次氯酸钠消毒10 min+0.1%升汞消毒9 min的效果最佳,污染率为6.67%,成活率为85.00%。
表1 不同消毒剂组合对外植体消毒效果的影响
不同pH 值对H5 蓝莓外植体腋芽增殖倍数的影响如表2 所示。不同pH 值对H5 蓝莓的分枝数量、分枝高度和腋芽数均有显著影响,当pH 值为5.4 时,每个外植体的分枝数和每个分枝的腋芽数最多,分别达到4.58、6.45 个,其腋芽增殖倍数达到29.54 倍。
表2 不同pH值对外植体腋芽诱导率的影响
不同基础培养基对H5 蓝莓分枝数和腋芽增殖倍数的影响较大,结果见表3。其中1/2 MS 和改良WPM 培养基对丛生芽诱导效果较好,每个外植体平均分枝数分别达到5.24、5.98 个,但是由于1/2 MS培养基营养相对缺乏,影响分枝正常生长,平均株高只有3.76 cm,分枝的平均腋芽只有4.21 个,在改良WPM 培养基中,每个分枝平均腋芽数达6.91 个,腋芽增殖倍数达41.32 倍。因此改良WPM 培养基适于作为H5 蓝莓腋芽增殖培养的培养基。
表3 基础培养基对H5蓝莓腋芽增殖倍数的影响
不同玉米素(ZT)浓度对H5 蓝莓分枝数和腋芽增殖倍数影响显著,结果见表4。由表4 可知,在生长素浓度一定的情况下,随着玉米素(ZT)浓度的增加,对丛生芽的分化具有显著促进作用,当玉米素浓度达到2.5 mg/L 时,分枝数量达到最多,每个外植体分化形成6.14 个分枝;玉米素(ZT)浓度继续升高,分枝数不升反降。此外,玉米素(ZT)浓度对分枝的伸长和腋芽分化也有显著影响,当玉米素(ZT)浓度达到2.0 mg/L 时,分枝平均腋芽数最多,达6.91 个,其腋芽增殖倍数也最高,达41.32 倍。
表4 不同玉米素浓度对H5蓝莓丛生芽诱导率的影响
合适的消毒剂组合和消毒时间是建立植物无菌系的关键。不同植物、不同组织、不同成熟度的外植体,携带微生物的种类、数量不同,对消毒剂的敏感性也不同。本研究选用当年生半木质化的健康枝条作为外植体,与成熟木质化枝条相比对消毒剂更加敏感。结果表明,H5 蓝莓外植体采用1%次氯酸钠消毒10 min+0.1%升汞消毒9 min 时,消毒效果最佳,污染率为6.67%,成活率为85.00%。这与李军萍等(2011)[12]提出的奥尼尔蓝莓外植体最佳消毒方式基本一致。
不同的基础培养基其无机离子、有机物质的组成和浓度存在较大差异[13]。结果表明,1/2 MS 培养基相比于MS 培养基更适合蓝莓生长,这可能是因为蓝莓对氮、磷、钾、钙、镁等大量元素需求较少,微量元素浓度高时反而不利于蓝莓生长。改良WPM培养基中氮、磷、钾等大量元素浓度介于MS 和1/2 MS 培养基之间,既能满足蓝莓生长对各营养素的需求,又避免了离子浓度过高产生的抑制作用[14-15]。
本研究结果表明,以当年生半木质化枝条为外植体时,1%次氯酸钠消毒10 min+0.1%升汞消毒9 min 有利于建立H5 蓝莓无菌系。以改良WPM 作为基础培养基,pH 值为5.4,添加0.2 mg/L 吲哚乙酸(IAA)和2.0 mg/L 玉米素(ZT)时,对丛生芽的诱导和腋芽增殖最有利,培养60 d,腋芽增殖倍数达41.32 倍。