CFS 预处理对不同秸秆原料酶解和理化结构的影响

田 鑫，王雨萌，徐师苗，汪强杰，胡 轲，张海波，程红艳

（山西农业大学 资源环境学院，山西 太谷 030801）

环境问题和能源多样化导致人们对生物质可再生资源日益关注。木质纤维素生物质分布广泛、储量巨大，具有生产生物燃料的巨大潜力[1]。木质纤维素生物质由纤维素、半纤维素和木质素组成，可分为草、作物秸秆、阔叶林和针叶林等[2]，其中作物秸秆由于来源广泛，易被生物转化，受到研究者广泛关注。通常作物秸秆会被遗弃田地随意堆放或被焚烧处理，导致严重的环境问题及资源浪费[1]，故将其资源化利用迫在眉睫。未处理作物秸秆由于木质纤维素的紧密结构，很难用于高效的生物燃料生产。因此，通过有效的预处理方式去除木质素、破坏紧密结构是高效利用作物秸秆不可或缺的一环[3]。

高铁酸钾（K2FeO4）拥有极强氧化性，是一种新型高效多功能水处理剂，在废水处理中被广泛应用[4-5]。次氯酸盐氧化法是一种成熟的高铁酸钾制备技术，其原理是在强碱溶液中加入过量ClO-氧化Fe3+制备高浓度的K2FeO4溶液，再经结晶、纯化干燥后形成固体K2FeO4[6]。高铁酸钾复合液（CFS）是制备高铁酸钾的剩余废弃滤液，其内含有大量碱（OH-）与氧化剂（Fe6+和ClO-）[7]。大量研究已证实，OH-和ClO-具有断裂木质素与半纤维素间的酯键以及木质素间的醚键，降解木质素，破坏木质纤维素复杂结构的作用[8-11]。由此推测，CFS 同样具备较强的木质纤维素降解能力。然而，目前并无CFS 预处理木质纤维素原料的相关报道。

玉米秸秆（CS）、高粱秸秆（SS）和谷子秸秆（MS）为山西省主要粮食作物秸秆，每年产量高达1 600 万t[12]。这3 种秸秆的生物转化潜力已被报道过，例如LI 等[13]采用高温烘烤对玉米秸秆进行预处理，还原糖得率提高了46.41%。DAI 等[14]以高粱秸秆生物废料为原料，经葡萄糖酸预处理后的高粱秸秆固体可获得90.8%的酶解率。YADAV等[15]利用球形毛壳菌对珍珠谷子秸秆进行预处理，发现在预处理后的珍珠谷子秸秆中添加降解细菌可提高沼气产量57%。由于3 种秸秆原料化学组分、理化结构具有差异性，其生物转化潜力也不同。此外，酶水解产糖率是评估预处理的关键指标[16]。

本研究采用CFS 对CS、SS 和MS 进行预处理，首先，评价了CFS 预处理对3 种秸秆的酶解糖化效果；其次，分析了CFS 预处理前后3 种秸秆木质纤维素含量的变化；最后，利用扫描电镜（SEM）、原子力显微镜（AFM）、傅立叶变换红外光谱（FTIR）、X-射线衍射仪（XRD）、热重（TG）等测试技术，对比分析了CFS 预处理前后3 种秸秆理化结构的变化，进一步评估了CFS 预处理3 种秸秆的效果。CFS 为制备高铁酸钾的剩余废液，采用CFS对作物秸秆进行预处理实现了“以废治废”的目的，可为生物能源的生产提供新思路。

1 材料和方法

1.1 试验材料

CS、SS、MS 均取自山西省晋中市太谷区，新鲜秸秆切断至1～2 cm，风干，于60 ℃烘箱烘干、粉碎后过0.25 mm 筛，储存备用。试验中所用的水解酶为纤维素酶（50 U/mg）和葡萄糖苷酶（100 U/g）。Fe（NO3）3ˑ9H2O、KOH、NaClO、3，5-二硝基水杨酸等药品均为分析纯，购自天津市化学试剂有限公司。

1.2 预处理试验

在预处理前，采用次氯酸钠法[7]制备高铁酸钾，收集其滤液即为CFS，滤液内Fe6+、ClO-、OH-的含量分别为40.2、704.5、2 500.1 mmol/L。预处理试验在250 mL 三角瓶中进行，固液比设置为10%（m/V）。具体操作步骤为：首先将秸秆粉末置于三角瓶中，加入CFS 并将三角瓶放入25 ℃恒温振荡器（SHZ-82A，常州，华冠）中，同时设置不同预处理时间（3、6、12、24、48 h）。在规定时间内取样，用去离子水多次冲洗样品，将其置于60 ℃的烘箱中烘干后称量装袋，备用。所有试验均进行3 次重复。

单独OH-预处理试验所采用的化学试剂为KOH，配制浓度等同于CFS 中OH-浓度，其余操作步骤同上。

1.3 酶解糖化

称取0.8 g 预处理样品置于100 mL 塑料瓶中，加入经121 ℃高压蒸汽灭菌20 min、pH 值为4.8的0.1 mol/L 的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，使酶解液总体积为40 mL。然后分别加入纤维素酶（50 U/mg）和葡萄糖苷酶（100 U/g），将其置于50 ℃的培养箱中酶解糖化48 h，经离心分离后取上清液，测定滤液中还原糖含量。

式中，C代表根据标准曲线上计算出的样品测定管中葡萄糖含量（mg）；Vt代表样品提取液总体积（mL）；W代表样品干质量（g）；Vs代表测定时取样体积（mL）。

1.4 指标分析方法

采用分光光度法[17]在515 nm 波长下测定Fe6+的浓度；向紫红色CFS 中加入Ba（NO3）2，通过生成难溶物BaFeO4去除滤液颜色，获取无色滤液后，再分别采用碘量法[18]和滴定法（酚酞指示剂）测定滤液中的ClO-和OH-；使用DNS 法[19]测定溶液中还原糖含量；采用Van Soest 法[20]测定秸秆中的纤维素、半纤维素和木质素含量；秸秆样品喷金后，利用扫描电镜（Regulus8100，日本，日立）观察预处理前后秸秆表面形态变化；使用原子力显微镜（Bruker Dimension lcon，德国，Bruker）采集预处理前后秸秆样品的振幅图和三维高度图；秸秆样品经KBr 压片后，置于PerkinElmer 傅立叶红外测试仪（Tensor 27，德国，Bruker）中扫描测定表面官能团结构变化；采用XRD 仪（布鲁克D8 advance，德国，Bruker）分析秸秆样品，并计算纤维素结晶度[21]；将预处理前后秸秆样品干燥后用同步热分析仪（STA 449C，德国，耐驰）分析样品的热稳定性。

1.5 数据分析

采用Microsoft Excel 2016 软件整理试验数据；使用Origin Pro 2018 软件作图；使用SPSS 22.0 软件（P＜0.05）进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 预处理对3 种秸秆酶解糖化的影响

酶水解产糖率是评估预处理效率的关键指标[16]。3 种秸秆的还原糖产量随CFS 预处理时间变化趋势如图1 所示，未处理的CS、SS、MS 的还原糖产量较低，分别为88.76、86.39、65.36 mg/g。当预处理时间由3 h 增加至24 h 时，3 种秸秆的还原糖含量显著升高（P＜0.05），随预处理时间继续增加，还原糖含量基本保持不变，且差异不显著（P＞0.05）。在最佳预处理时间24 h 时，CS 的还原糖含量最高，为313.12 mg/g，其次为SS（290.61 mg/g），MS 的还原糖含量最低（206.97 mg/g），较未处理对照分别显著提高了252.77%、236.39%、216.66%（P＜0.05）。以上结果充分说明，CFS 预处理可成功破坏秸秆紧密结构，促进后续的酶解糖化过程，同时最佳预处理时间为24 h。相较SS 和MS，预处理前后CS 的还原糖含量最高，说明CS 生物转化潜力最大，这可能是由秸秆内部化学组成和理化结构共同决定的。

图1 预处理时间对3 种秸秆酶解糖化的影响Fig.1 Effects of pretreatment time on enzymatic hydrolysis and saccharification of three kinds of straw

为进一步了解CFS 对秸秆的降解情况，分析了CFS与单独OH-预处理（浓度同CFS中OH-浓度）对3 种秸秆还原糖含量的影响，结果如图2 所示，经单独OH-预处理后，CS、SS、MS 的还原糖含量较未处理分别显著提高了207.72%、179.50%、138.34%（P＜0.05）。而经CFS 预处理后，CS、SS、MS 的还原糖含量则高于单独OH-预处理，分别较单独OH-预处理显著增加了14.64%、15.56%、15.12%（P＜0.05）。说明OH-和CFS 预处理均可降解木质纤维素，增加纤维素酶的可及性。

图2 CFS 和单独OH-处理对3 种秸秆酶解糖化的影响Fig.2 Effects of CFS and individual OH- treatments on enzymatic hydrolysis and saccharification of three kinds of straw

CFS 预处理效果明显优于单独OH-预处理，暗示CFS 中氧化剂（ClO-/Fe6+）在秸秆的降解过程中发挥一定的作用。氧化还原电位（ORP）是反映体系中所有物质表现出来的宏观氧化-还原性[22]，ORP 越高，则氧化性越强。由预处理过程中ORP 变化趋势可知（图3），CFS 预处理3 种秸秆在前24 h 的ORP值由400 mV 显著降低至-800～-600 mV（P＜0.05），进一步验证了CFS 中氧化剂参与了秸秆降解。

图3 CFS 和单独OH-处理对3 种秸秆预处理过程中ORP 变化的影响Fig.3 Effects of CFS and individual OH- treatments on ORP changes during pretreatment of three kinds of straw

2.2 预处理前后化学组分含量的变化

木质纤维素生物质主要由纤维素、半纤维素和木质素等成分组成，这些成分共同构成了复杂三维网状结构，尤其是木质素对纤维素和半纤维素的保护作用，使纤维素酶难以在酶解过程中直接接触纤维素[23]。由图4 可知，3 种秸秆木质素含量为CS 和SS 较低，而MS 最高；纤维素含量大小则表现为CS＞SS＞MS。CS 含丰富纤维素和较少木质素的特点，暗示其生物转化潜力较强。经CFS 预处理后，与未处理相比，CS、SS、MS 纤维素含量分别提高了26.75%、19.71%、10.50%，且差异显著（P＜0.05），木质素含量分别显著降低了51.81%、41.30%、26.43%（P＜0.05），半纤维素含量分别显著降低了29.33%、12.61%、8.18%（P＜0.05）。说明CFS 预处理已去除了大量的木质素和半纤维素，导致纤维素相对含量升高，这可能与复合液中碱和氧化剂具有破坏木质素与半纤维素间的酯键以及木质素间的醚键的能力相关[24-25]。虽然CFS 预处理对MS 木质素有一定程度的去除，但其内部高含量木质素与纤维素和半纤维素形成的紧密交联结构使得木质素去除效果不如CS 和SS 明显。另外，MS 纤维素含量低的特点导致其酶解效率远低于CS 和SS（图1）。

不同小写字母表示同种木质纤维素不同处理间差异显著（P＜0.05）The different lowercase letters indicated significant difference between the different treatments of the same lignocellulose(P＜0.05)图4 CFS 预处理前后3 种秸秆的化学组分含量Fig.4 Chemical components content of three kinds of straw before and after CFS pretreatment

2.3 预处理前后秸秆形态结构的变化

2.3.1 预处理前后秸秆扫描电镜（SEM）分析 为进一步了解秸秆的微观结构变化，利用扫描电镜（SEM）观察预处理前后3 种秸秆表面形态，结果如图5 所示，未处理的秸秆纤维结构完整且紧密，形状规则，排列整齐，表面光滑，无明显的破坏，这些纤维层会阻碍了微生物对秸秆的利用。经过CFS预处理后，秸秆的表面形态变化明显。预处理后的CS 表面结构发生扭曲和破坏，表面粗糙度增加，呈中空结构，SS 的表面纤维排列疏松、膨胀并伴有裂纹，MS 纤维表面暴露程度增加并出现裂纹。预处理对CS 表面形态的破坏较SS 和MS 更为严重，原因可能是由于CFS 预处理CS 后去除更多的木质素或半纤维素，使秸秆表面粗糙并出现裂纹，这会增大秸秆的表面积，有利于进一步酶解反应。

图5 CFS 预处理前后3 种秸秆的SEM 图像Fig.5 SEM images of three kinds of straw before and after CFS pretreatment

2.3.2 预处理前后秸秆AFM 分析 原子力显微镜（AFM）形成的高分辨率形貌图，可在纳米尺度上显示秸秆表面微观结构的变化[26]。预处理前后3 种秸秆的振幅图和三维高度图如图6 所示，AFM图像的明暗分别代表秸秆的亲疏水性，纤维素是亲水的（每个糖环含有3 个羟基），而木质素是疏水的[27]。未处理秸秆表面有1 层疏水性的木质素，振幅图颜色较暗，说明秸秆原料含较多的木质素；而CFS 预处理后秸秆表面明亮，这表明部分木质素被去除，更多的亲水性纤维素被暴露出来[27]。在3 种秸秆中，MS 的颜色最深，这与其木质素含量高的分析结果一致（图4）。另外，粗糙度参数Ra和Rmax（表1）分别代表平均表面粗糙度以及高、低数据点之间的最大垂直距离，其数值越大代表秸秆表面越粗糙。预处理后CS、SS、MS 的粗糙度参数Ra分别从处理前的17.8、13.5、13.0 nm 增加到122.0、25.7、19.3 nm，Rmax分别从处理前的192、147、117 nm 增加到890、754、471 nm。说明预处理后3 种秸秆的粗糙度均增加，其中CS 粗糙度最大，这与SEM 的观察结果一致（图5）。

表1 CFS 预处理前后3 种秸秆表面粗糙度参数Tab.1 Surface roughness parameters of three kinds of straw before and after CFS pretreatmentnm

图6 CFS 预处理前后3 种秸秆的AFM 图像Fig.6 AFM images of three kinds of straw before and after CFS pretreatment

2.3.3 预处理前后秸秆FTIR 分析 FTIR 可分析预处理前后3 种秸秆表面官能团和化学键变化，从而定性推测3 种秸秆化学组分变化。3 种秸秆预处理前后的FTIR 进行了比较，结果如图7 所示，预处理前后3 种秸秆的特征吸收峰形状基本相似，但一些特征峰呈不同程度的增强或减弱，说明CFS 预处理改变了秸秆的化学组分和结构。其中，在波数3 326 cm-1处出现宽峰，对应纤维素分子间氢键引起的-OH 伸缩振动[28]；波数2 917 cm-1处代表纤维素-CH2的拉伸振动[27]，CFS 预处理可使上述2 波峰明显变宽或变强；波数890 cm-1处是纤维素内葡萄糖单元间β-糖苷键的特征峰[23]，预处理增强了该处波峰强度，说明CFS 预处理可有效保留纤维素，使纤维素相对含量增加。在波数1 735 cm-1处非共轭羰基-C=O 伸缩振动的吸收峰是木质素-半纤维素复合物的糖醛酸酯基团特征峰[9]，在预处理后明显减弱或消失，这是由于CFS 中的OH-能与酯键发生皂化反应，使得木质素与纤维素、半纤维素间的结构被打开，乙酸和酚类物质被释放出来[29]。波数1 235 cm-1处的吸收峰为木质素（愈创木基）中C=O 的伸缩振动[9]，波数1 605、1 515 cm-1的振动可归因于木质素链的芳香C-C 拉伸[26]，波数834 cm-1处为木质素中紫丁香基中的C-H 面外弯曲振动[30]。CFS 预处理后可减弱以上4 个峰的强度，说明预处理后3 种秸秆中有大量木质素被溶解。

图7 CFS 预处理前后3 种秸秆的FTIR 图像Fig.7 FTIR images of three kinds of straw before and after CFS pretreatment

2.3.4 预处理前后秸秆XRD 分析 纤维结晶度（CrI）也会影响木质纤维素生物质酶解效率[31]。预处理前后3 种秸秆的XRD 图谱如图8 所示，图谱22.46°处为结晶区特征峰，15.98°处为非结晶区特征峰，所有图谱均在22.46°和15.98°附近出现2 个特征峰，说明预处理对秸秆的晶体类型没有显著影响，仍为结晶和非结晶区共存。而经CFS 预处理后，结晶区特征峰强度明显增大，峰值更尖锐。根据Segal 公式[21]计算可知，预处理后3 种秸秆的CrI大小分别表现为CS（55.40%）＞SS（49.30%）＞MS（44.44%），分别较未处理增加了26.77%、26.60%和23.17%。以上结果说明CFS 主要破坏秸秆的非结晶区，使部分的可溶性多糖、木质素、半纤维素和非晶型纤维素等无定形区域物质被溶解，导致结晶纤维素相对含量升高[32]，这与其他研究结果相类似，例如，稀酸预处理、蒸汽爆破和碱性H2O2预处理秸秆[30,32-33]。预处理后CS 的结晶纤维素相对含量最高，高的纤维素含量可为纤维素酶提供更多反应底物，这进一步验证了预处理后CS 含丰富纤维素和较少木质素（图4）且酶解效率高（图1）的结论。

图8 CFS 预处理前后3 种秸秆的XRD 图像Fig.8 XRD images of three kinds of straw before and after CFS pretreatment

2.3.5 预处理前后秸秆TG 分析 通过TG 分析可测定木质纤维素的热稳定性[27]。热解过程的TG 曲线和DTG 曲线如图9 所示，半纤维素、纤维素和木质素的降解温度分别为180～340、230～450、180～900 ℃[28]。由图9 可知，秸秆预处理前后的热解经历了3 个阶段：干燥、高效热解和成炭，这与其他生物质热解过程类似，如松木[34]、帕拉草[35]和珍珠谷子残渣[36]。干燥阶段的温度范围为室温至150 ℃，主要涉及表面张力保持的外部水分和细胞内部水分的释放[37]。高效热解阶段（150～600 ℃）主要涉及挥发性产物释放，半纤维素和纤维素完全降解与木质素部分降解[28]。第2 阶段的质量损失最大，为72.87%～91.50%。第3 阶段（600～900℃）主要为木质素分解阶段，失重率为2.65%～10.48%。由图9 还可知，CFS 预处理后3 种秸秆DTG 曲线的峰值温度均发生了变化，但不影响降解过程。预处理前CS、SS、MS 的峰值温度分别为349.18、354.88、346.04 ℃，预处理后CS、SS、MS 的峰值温度分别为355.48、356.54、357.58 ℃。此外，预处理后3 种秸秆的最大质量损失速率（DTGmax）也随之提高，预处理前CS、SS、MS 的DTGmax分别为每分钟12.22%、13.42%、8.07%，预处理后的DTGmax分别升高至每分钟17.32%、15.69%、14.52%。说明预处理后3种秸秆的热稳定性均变差，其原因可能是预处理使3 种秸秆的纤维素含量升高。与SS 和MS 相比，CS的热稳定性最差，故其被转化为生物燃料的潜力最大。

图9 CFS 预处理前后3 种秸秆的TG 和DTG 图像Fig.9 TG and DTG images of three kinds of straw before and after CFS pretreatment

3 结论与讨论

CFS 可有效破坏作物秸秆顽固结构促进酶解糖化过程。本研究通过分析对比CFS 预处理对3 种秸秆酶解糖化的影响发现，在最佳预处理时间24 h下，CS、SS 和MS 的还原糖含量分别较对照提高了252.77%、236.39%、216.66%，CS 的酶解糖化效率最高；CFS 预处理中碱和氧化剂共同参与了木质纤维素的降解；ORP 变化进一步验证了CFS 中氧化剂参与了降解秸秆。高静等[38]使用离子液预处理水稻秸秆，1-乙基-3 甲基咪唑醋酸盐/环己烷/TX-100/正丁醇微乳液在500 MPa、50 ℃预处理4 h，还原糖产率为75.3%。JIN 等[2]采用高压均质预处理玉米秸秆，虽然没有废液产生，但该处理耗能高，且还原糖含量仅为161.62 mg/g，较对照提高68.4%。MA 等[24]用2%（W/V）的碱性高锰酸钾预处理玉米芯，在50 ℃预处理6 h，还原糖产量为对照的1.44 倍。陈思哲等[39]用氢氧化钠预处理水稻秸秆，在80 ℃预处理3 h，还原糖含量为480.81 mg/g，较对照提高了262.3%。上述研究预处理成本高，且预处理效果低于本研究。与不同处理的预处理技术相比，CFS 预处理是一种有效且成本低廉的处理技术。

本研究通过分析对比CFS 预处理对3 种秸秆理化结构的影响发现，CFS 预处理能有效去除3 种秸秆中木质素成分，增加纤维素相对含量，破坏秸秆的紧密结构，提高了纤维素酶的可及性；CFS 预处理后，3 种秸秆的理化结构发生了不同程度变化，粗糙度增加，官能团发生断裂，纤维素结晶度升高，热稳定性降低，3 种秸秆中，CS 变化最明显，其生物转化潜力最大。秸秆中纤维素成分与木质素、半纤维素成分紧密结合，使得酶分子难以与纤维素分子接触，阻碍了纤维素的酶解反应[39]。木质素的去除可以增加底物与纤维素酶或微生物的接触机会，从而提高木质纤维素的糖化率[38]，有利于秸秆的资源化利用。纤维结晶度升高说明预处理去除了秸秆中的木质素和半纤维素成分，破坏了纤维素的无定形结构[39]，可为纤维素酶提供更多的反应底物，从而提高酶解糖化效率。木质素的降解和结晶度的升高等指标的变化，说明CFS 预处理能有效破坏木质纤维素的复杂顽固结构，有利于后续酶解糖化，被微生物所利用。

综上，CFS 预处理破坏作物秸秆的致密结构，促进酶解效率，是一种理想的预处理方法。此项预处理技术的研究结果实现了“以废治废”的绿色环保目标，为农业废弃物的资源化利用提供了新思路。