基于高效液相色谱测定白酒中乳酸和乙酸的方法研究

张 婷，胡来丽，时 源，杨 果，何世兴

（1.四川郎酒股份有限公司，四川古蔺 646523；2.四川省酱香型白酒生态酿造工程技术研究中心，四川泸州 646523）

为准确定量白酒中乳酸含量，本研究采用高效液相色谱法，选用磷酸二氢钠作为流动相体系，加入不同比例甲醇，用5%乙醇制备标准溶液以排除乙醇对乳酸、乙酸保留时间的干扰，建立标准曲线，并通过精密度和加标回收试验，以验证方法的准确性。利用该方法找出不同香型白酒中有机酸的差异性，并选取原酒蒸馏过程中的前段、中段、尾段酒样进行分析，以期为白酒中乳酸含量测定提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

样品：酱香、浓香、清香3 种香型酒样各10 个，市购；选取原酒蒸馏过程前段、中段、后段酒样各1个。

试剂：甲醇（fisher）、乙醇（西陇科学股份有限公司）、乳酸（天津市光复化工研究所）、乙酸（天津市光复化工研究所）均为色谱纯；磷酸（成都市科隆化学品有限公司）、磷酸二氢钠（天津市科密欧化学试剂有限公司）均为优级纯。

仪器设备：Waters 2695 超高效液相色谱仪，配2489 紫外检测器；Milli-Q（IQ7010）纯水系统；pH仪，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；万分之一分析天平，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；0.22 μm有机滤膜，天津市津腾实验设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 流动相配制

配制浓度为20 mM磷酸二氢钠，并用磷酸调节pH至2.7。

1.2.2 样品前处理

总之，迪士尼乐园与色彩丰富的美国西海岸摄影艺术都曾在斯各格兰德身上打下印记。同时出现在其作品中的，还有美国恐怖电影的痕迹，以及美国中产阶级的焦虑——斯各格兰德擅长以讽刺手法来表现这一点。她的作品中显然飘荡着一种城郊居民的忧郁气息。她承认对平庸充满兴趣，“我自己也出身于中产阶级，从品味来看，我的阶层正是我做出许多选择的根源。”

将样品稀释过0.22 μm 水系滤膜，待上机分析。

1.2.3 定性实验

分别配制乳酸、乙酸标准溶液，在相同条件下进行检测，根据乳酸、乙酸保留时间定性。

1.2.4 标准曲线的制作

准确称取0.10 g 乳酸、乙酸至100 mL 容量瓶，分别用不同浓度乙醇溶液溶解并定容到100 mL，配制成浓度为100 mg/100 mL 乳酸、乙酸储备液。用该储备液配制浓度为0 mg/100 mL，5 mg/100 mL，10 mg/100 mL，25 mg/100 mL，50 mg/100 mL，100 mg/100 mL 的乳酸、乙酸混合标准溶液并建立标准曲线。

1.2.5 色谱条件

色谱柱：XSelect HSST3 (4.6 ×250 mm，5 μm)；柱温30 ℃；流速1.0 mL/min；进样量为10 μL；流动相A 为磷酸二氢钠，B 为甲醇；配紫外检测器，检测波长为210 nm，分别在A∶B=95∶5 和A∶B=90∶10的流动相比例下进行测定分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的建立

白酒样品中主要成分为乙醇和水，考虑基质对分析结果的影响，分别用纯水和10 %乙醇溶液配制标准溶液建立标准曲线。由图1 和图2 可看出，乙醇影响分离程度，乳酸保留时间为5.5 min。

图1 纯水配制标准曲线

图2 10%乙醇配制标准曲线

XSelect HSS T3 5 μm 4.6×250 mm为反相色谱柱，通过加入5 %、10 %甲醇提高色谱柱分离程度。图3 为流动相中加入5%甲醇、用10%乙醇作为溶剂建立的标准曲线，乳酸、乙酸保留时间提前，出现乳酸峰前移及乙酸峰拖尾现象。

图3 流动相中加入5%甲醇、10%乙醇作为溶剂建立的标准曲线

图4 为流动相中加入10 %甲醇、10 %乙醇作为溶剂建立的标准曲线，乳酸保留时间提前至4.0 min，峰分离效果好。

图4 流动相中加入10%甲醇、10%乙醇作为溶剂建立的标准曲线

考虑乙醇对保留时间及结果的影响，将样品分别稀释至1 %vol、2 %vol、3 %vol、4 %vol、5 %vol、6 %vol、7 %vol、8 %vol、9 %vol。结果发现乳酸保留时间不变，乙酸保留时间受乙醇浓度影响，随乙醇浓度增加而提前。酒精度范围在10%vol 内，乙酸保留时间差异为0.1 min（见图5）。根据流动相中不同乙醇浓度对保留时间的影响，综合考虑将该方法优化为浓度为20 mM、pH2.7 磷酸二氢钠流动相中加入10%甲醇，用5%vol 乙醇溶液配制乳酸、乙酸标准溶液建立标准曲线。

图5 不同乙醇浓度对乳酸、乙酸保留时间的影响

2.2 线性关系及检出限

采用浓度为20 mM、pH2.7 磷酸二氢钠，加入10%甲醇流动相，用5%乙醇作为溶剂建立标准曲线，对配制的不同浓度系列标准溶液进行检测，得到标准曲线。乳酸、乙酸的保留时间、线性范围、标准曲线回归方程、相关系数及检出限见表1。

表1 乳酸乙酸HPLC分析标准曲线

相关系数R2均＞0.9999，可满足定量检测要求。以信噪比（S/N)=3确定检出限，能够满足实验室的检测需求[5]。

2.3 精密度试验

配制浓度为2 mg/100 mL、20 mg/100 mL、80 mg/100 mL 的标准溶液，用上述方法进行6 次平行测定，计算乳酸和乙酸在不同浓度下测定结果的平均值及RSD。由表2 可知，乳酸、乙酸精密度试验结果相对标准偏差均＜1.0 %，说明该方法的精密度良好，可用于白酒样品的检测。

表2 精密度试验结果 （n=6)

2.4 加标回收率试验

在含量约为40 mg/L 的标样中，加入40 mg/L的标准品，平行测定3次，计算平均回收率和RSD，结果如表3所示。

表3 加标回收率试验结果 (n=3)

由表3 可知，乳酸的加标回收率在102 %～103%之间，乙酸的加标回收率在104%～106%之间，RSD 均＜0.5%，表明该方法的测定结果准确度较好。

2.5 3种香型白酒四大酸的测定分析

选取3 种香型不同厂家酒样各10 个，稀释为乙醇浓度≤5%vol 样品，过0.22 μm 有机滤膜，进行乳酸、乙酸测定，用气相色谱法进行丁酸、己酸分析，用指示剂法对总酸进行测定，结果见表4。

对比得出不同香型白酒四大酸存在差异性，其中酱香型白酒乳酸、乙酸和总酸较高；浓香型白酒己酸较高；清香型白酒乙酸较高。初步得出白酒四大酸指标差异性可影响白酒风格及香型[7]。

2.6 前、中、尾段酒样四大酸结果分析

选取原酒蒸馏过程前段、中段、尾段酒样，用此方法进行四大酸分析，结果见表5。对比得出，有机酸随着馏酒时间的延长呈上升趋势，有机酸与馏酒时间呈正相关。鉴于此，可进一步开展白酒馏分风味物质的分析，并结合生产实际对白酒馏酒工艺提供技术指导[7]。

表5 前段、中段、尾段酒样四大酸含量 (g/L)

3 结论

本研究确立了高效液相色谱法检测白酒中乳酸、乙酸含量的方法，其标准曲线相关系数、精密度、加标回收率均能满足试验要求。通过研究不同体积分数乙醇对乳酸、乙酸保留时间和峰形的影响，在浓度为20 mM、pH2.7 磷酸二氢钠加入10 %甲醇流动相，以便于增加乳酸、乙酸分离程度，用5%乙醇溶液配制标准溶液建立标准曲线，样品稀释为乙醇含量低于5%vol时，可以提高检测结果的准确性。

利用该方法对酱香、浓香、清香3 种香型白酒的乳酸、乙酸进行测定，用气相色谱法对己酸、丁酸进行测定，用指示剂法对总酸进行测定，可准确检测出各酒样中乳酸、乙酸、丁酸和己酸的含量差异。对馏酒过程中前段、中段、尾段酒样中的四大酸进行测定，可知有机酸含量与馏酒时间呈正相关。本研究所提出的方法可用于白酒样品中乳酸、乙酸的检测，所得结果准确、可靠。