微生物学快速现场评价在肺部感染应用中面临的问题、争议及对策

杨幸乐 夏婷婷 封岩 左春磊 史家欣

近年来，随着人口老龄化、环境污染及器官移植的增多，肺部感染发病率逐渐增高。临床医生在微生物检查结果出来之前，大多采用经验性治疗方案，而经验性治疗目标性较差。因此，临床上迫切需要一种即时性好、指导性强的检查手段来指导初始抗菌治疗[1]。微生物学快速现场评价（Microbiology rapid on-site evaluation，M-ROSE）是一项对采集的感染源标本（气道分泌物或者支气管肺泡灌洗液等）进行现场制片染色，并在短时间内根据感染病原标本的染色结果得出初步诊断的技术，特别适合感染性肺炎的诊疗需求[2]。近年来，M-ROSE 正逐步应用于各类介入肺脏病学操作中，如虚拟支气管镜（Virtual bronchoscopy，VBN）、支气管内超声（Endobronchial ultrasound，EBUS）、支气管镜电磁导航（Electromagnetic navigation，EMN）、全肺实时诊疗导航（Lung-Pro）支气管镜、机器人辅助的支气管镜等[3]。同时，在指导呼吸危重症患者的早期诊治、确认取材满意度、协助标本分流等方面也发挥着重要作用[4]。研究显示，以实验室结果为金标准，M-ROSE 在真菌诊断方面准确率超过90%，在结核及铜绿假单胞菌的诊断方面准确率约为100.00%，且 M-ROSE 的平均时间比痰细菌培养的时间短1 000 多倍[5，6]。尽管M-ROSE 优点很多，但是M-ROSE 在临床应用中也面临较多问题及争议。本研究从取材、制片、染色和判读四个方面总结M-ROSE 面临的问题，并讨论M-ROSE 现存的争议，提出相应的解决对策，为M-ROSE 技术的未来发展提供参考。

1 M-ROSE 面临的问题

1.1 标本采集面临的问题

1.1.1 呼吸道样本易污染、难甄别 临床多会选择支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid，BALF）或痰标本进行M-ROSE 操作。然而，BALF 在取材过程中易混杂口腔及主气道的杂菌，不易区分污染或定植[7]。同时，支气管肺泡灌洗（Bronchoalveolar lavage，BAL）不易获取肺组织深在的病原，如耶氏肺孢子菌、巨细胞病毒等。痰液标本则易受口腔定植菌污染，使病原菌检出率下降甚至病原学诊断错误。1.1.2 取材的准确性受医院介入设备水平的限制M-ROSE 由标本采集、制片、染色和判读四部分组成，准确获取靶病灶是M-ROSE 正确判读的基础[4]。2010 年以来，以VBN、超细支气管镜、EBUS、EMN等高新技术设备为代表的介入肺脏病学诊疗设备应用于临床，极大地提高了取材的准确性[8]。然而，由于该类设备造价较高，操作相对复杂，耗材昂贵，以至于国内一些医院无法配备，更多的是使用普通支气管镜等传统方式进行取材，有些病灶应用常规介入技术难以准确获取，导致标本质量参差不齐，从而影响M-ROSE 结果的准确性。

1.2 制片与染色问题M-ROSE 技术的核心是快速评价并实时反馈指导临床诊疗，因此，制片与染色的质量和速度对M-ROSE 技术具有重要的临床意义[3]。然而，各种制片与染色方式的适用情况不尽相同，制片和染色技师的水平不一，这些问题均可能影响M-ROSE 的判读结果[9]。

1.3 判读问题M-ROSE 操作易受主客观因素影响，以致判读结果产生偏差。主要影响因素包括：①临床医师和检验科医师沟通不充分易导致误诊。研究发现，检验科医师在分析M-ROSE 结果时，若结合临床医师提供的病史、查体、影像学、实验室检查报告等综合分析，则准确率会更高[10]。②M-ROSE操作时间紧迫，可能会对结果的准确性造成一定影响。在M-ROSE 操作过程中评估涂片质量的时间较短，操作人员极易在时间限制下将不合格的标本误判为合格，或导致标本结果的误判[11]。③检验科医师人才匮乏使M-ROSE 难以广泛开展。通常进行M-ROSE 操作需检验科医师携带显微镜至操作台旁或病房，脱离了其常规诊疗活动，因此开展M-ROSE的专业人员存在较大缺口[12]。

2 M-ROSE 的争议

2.1 M-ROSE 是否具有临床应用价值由于临床经验性治疗用药目标性不强，所以常会导致诊断延误、治疗周期延长、增加患者住院费用等后果。国外有研究表明[13]，社区获得性肺炎的治疗中，以病原为导向用药相较于经验性治疗，患者的抗菌药物使用时长和住院时长明显缩短，住院费及30 天死亡率也有所下降。国内一项重症肺炎诊治的临床实验结果显示，M-ROSE 指导组较经验性治疗组（对照组），患者入院后病原结果回报更早、炎症指标下降更快、病死率更低[14]。且研究显示，以痰培养结果为金标准，M-ROSE 对真菌的诊断率超过90%，对结核及铜绿假单胞菌的诊断率为100.00%，且M-ROSE 的平均时间比痰培养的时间短1 000多倍[6]。由此可见，M-ROSE 作为一种新的快速病原诊断技术可初步指导肺部感染患者抗菌药物的选择，并做为介入取材的质量保证措施，具有便捷、高效、成本低廉的优点，临床应用价值较高[15]。

2.2 M-ROSE 在呼吸系统疾病应用中应遵循何种应用原则M-ROSE 技术历史悠久，但其应用原则尚未明确规范。综合国内外研究，M-ROSE 技术的应用应遵循以下原则：M-ROSE 结果应仅作为病原学的初判，为肺部感染患者早期治疗方案的选择提供参考，不能取代标本培养及药敏试验等确诊病原的“金标准”。因此，应避免以M-ROSE 结果为选择治疗方案的唯一证据，而取消后续本应作为常规的标本送检流程[16，17]。

2.3 M-ROSE 技术具体适用于何种情况M-ROSE正广泛应用于肺部感染性疾病的诊治过程中，但其具体应用范围一直没有明确界定。参考李雯等[4]所著指南，总结出M-ROSE 的应用范围主要包括：①与介入肺脏病学操作联合应用，以提高取材满意度，优化标本流向。②呼吸危重症患者及肺部疑难症患者应用M-ROSE，可快速反馈指导诊疗方案的制定。③诊断和治疗干预需同步进行或一次完成时，如感染性肺炎局部喷洒药物治疗。④手术演示、学术交流、技术培训或优化临床教学。

2.4 M-ROSE 是否具有成本效益优势M-ROSE 的成本效益一直有所争议，因为M-ROSE 技术操作过程中床旁至少需有一名检验科医师或接受过相关培训的临床医师全程参与，医师额外的时间和精力、染色剂及耗材等无疑会增加每次介入操作的成本[18]。但国外也有相关对照实验表明[19]，进行介入肺脏病学检查时，M-ROSE 组可明显提高标本的合格率，减少重复检查的次数，且M-ROSE 组增加的单次介入操作的成本远低于对照组因标本不合格而重复介入操作所产生的额外费用。同时，应用M-ROSE 技术可以提高诊断效率、改善患者预后、缩短患者住院天数，因而具有成本效益优势。

3 对策

3.1 增加硬件预算，优化标本采集方式

3.1.1 取材方式多样化，提高标本阳性率及准确性M-ROSE 操作人员可结合临床资料、肺部影像学特征等选择不同的取材方式，如：对肺组织深处感染灶使用经支气管镜防污染采样刷检来减少取材过程中混杂的杂菌；对气道和肺泡表面病灶可采用BAL 进行取材；对于有介入操作禁忌证的患者，可采用痰液标本进行快速病原学诊断；如遇到难以取材的病灶可同时选择两种或两种以上的取材方式[20，21]。

3.1.2 引进高新设备，加强培训操作方法 VBN、EBUS、EMN、超细支气管镜等介入设备与M-ROSE联合应用较常规支气管镜到达的支气管级数更高，更易取到肺组织深在病变，缩短定位病灶时间和操作时间，提高取材的准确性，减少并发症[16，22，23]。因而，医院可引进高新设备，系统培训操作方法，以此提高取材的准确性，提升医院的医疗水平。

3.2 提高制片与染色的质量和速度通过选择合适的制片与染色方式，提升制片与染色技师的业务水平来提高制片与染色的质量和速度[9]。如印片适用于经支气管镜肺活检（TBLB）、黏膜直视下活检、内科胸腔镜直视下活检、经皮组织切割针肺活检等，为最常用的一种制片方式；刷片适用于普通细胞刷、防污染细胞刷或超细细胞刷的刷检标本，以及痰液、黏稠体液等半液状标本；喷片适用于细针穿刺活检或常规经支气管镜针吸活检（TBNA）；留片适用于EBUS-TBNA[4]。操作者应充分了解各种制片方式的适用场景，选择最合适的制片方式。M-ROSE 的快速染色方法有：瑞氏染色、姬姆萨染色、迪夫快速染色、甲苯胺蓝染色、亮甲酚蓝染色、超快巴氏染色、快速苏木精和伊红染色等，WHO 推荐采用迪夫染液对标本进行“浸染”以提高染色的质量与效率[24]。同时，如果考虑为真菌感染，可针对性使用极快速改良乳酸染色，支原体感染可用快速支原体DNA 霍氏荧光染色，抗酸菌感染可使用快速金-罗耐酸菌荧光染色，球菌和杆菌则多应用试剂盒快速进行革兰染色[7]。操作者可根据具体情况来选择合适的染色方式。最后，可以通过建立规范的培训机制及考核制度，来提升操作人员的业务水平，保证M-ROSE 的实时性与准确性[25]。

3.3 提升判读效率，发挥M-ROSE 的临床应用价值

3.3.1 培训呼吸科医师，提高判读准确性 为提高M-ROSE 的诊断效率，可由呼吸科临床医师自行在患者床边进行M-ROSE 操作。研究表明[11，26]，在经过一段时间的微生物学知识培训后，呼吸科医师对M-ROSE 结果的判读准确率与专业的检验科医师无显著差别。并且呼吸科医师具有严密的临床专科逻辑整合能力及大量的专业知识储备，在面对染色结果时，结合患者病史、查体、影像学、实验室检查等综合分析，更易做出正确判断。因而常规培训呼吸科医师的微生物学相关知识，建立健全考核制度，不仅可以减少因临床医师和检验科医师沟通不充分导致误诊的情况，还为解决检验科医师人才匮乏的问题提供了一个出路。

3.3.2 相关科室配备M-ROSE 全套设备，床旁应用M-ROSE 呼吸道感染占医院感染的64.1%，因而有必要在呼吸科配备相应的玻片、试剂及专业显微镜等设备，经过培训的呼吸科医师在取到肺部感染患者呼吸道分泌物标本后可立即进行M-ROSE，初步判断患者所感染病原，早期选用合适的抗菌药物[4]。另外，进行气管镜等介入操作的科室也可配备全套设备，以提高标本合格率、优化标本流向。

3.3.3 应用远程细胞学（Telecytology，TC），实现多站点服务 TC 是一种在操作室与检验科医师之间传递标本图像和诊断信息的远程通讯技术。TC 具体操作过程：介入科医师或呼吸科医师在现场进行制片与染色后，标本经高清摄像头拍摄后通过特定网络系统传输给检验科医师，检验科医师在实验室就能进行判读，且研究证实，TC 并不影响M-ROSE 结果的准确性[27～29]。这就形成了一个检验科医师同时为多个介入中心进行标本判读服务的诊断体系，解决了检验科医师人才匮乏的问题。

4 总结及展望

综上所述，M-ROSE 是一项投入成本低，临床应用价值高的新型快速诊断技术，虽然M-ROSE 面临一些问题及争议，但亦有相应解决方法，可以作为肺部感染的早期诊断方法在国内推广应用。目前多采用气道分泌物或者BALF 标本进行检测，对于合并胸腔积液的患者，我们认为也可以考虑以胸腔积液作为标本进行M-ROSE。对于合并纵隔淋巴结肿大的患者，还可以通过超声支气管镜引导针吸活检。这些问题目前尚无统一标准，需要通过进一步临床实践决定是否将其纳入操作范围。在肺部感染早期，我们考虑是否可以将M-ROSE 技术与呼吸道病原体核酸检测、快速抗原检测等技术应用于早期快速诊断，从而增加M-ROSE 的内涵，提高病原体的检出率。