河南不同产区烤烟代谢物区域特征分析

2023-12-20 13:50周汉红孙书斌罗先学肖金胜方武军
湖北畜牧兽医 2023年11期
关键词:社旗县宜阳县泌阳县

周汉红,孙书斌,罗先学,肖金胜,甘 韬,方武军

(1.湖北中烟工业有限责任公司,武汉 430040;2.湖南省烟草专卖局张家界市公司,湖南 张家界 427000)

河南产区烤烟年生产量在10 万t 以上,是全国重要的浓香型卷烟优质产区,在卷烟品牌中发挥重要的配方作用,但河南各产区空间跨度大,土壤和气候条件也存在较大区别,导致烟叶风格在产区间存在一定的差异。学者对河南烟叶进行了大量研究,但主要集中在施肥、烘烤等烟叶生产方面[1-5]以及物理特性、化学成分等质量方面[6-13],对各产区烟叶代谢物质方面的研究比较少。

烟叶在成熟和烘烤过程中存在一系列复杂的生化反应,其中代谢物的种类和含量对烤烟的感官质量有重要的影响[14]。非靶向代谢组学旨在通过考虑数据集中存在的所有信息,在生物系统中收集尽可能多的代谢物的信息,广泛应用于植物代谢组学分析。其主要技术有液相色谱-质谱联用(LC-MS)、气相色谱-质谱联用(GC-MS)和毛细管电泳-质谱联用(CE-MS)等[15-17],其中液相色谱-质谱联用(LC-MS)具有可靠的灵敏度、较高的精度和分析方法的鲁棒性,是灵敏度和选择性的最佳组合,因此在大多数代谢组学方法中必不可少。本研究运用液相色谱-质谱联用(LC-MS)方法对河南省驻马店市泌阳县、南阳市社旗县、信阳市罗山县、洛阳市宜阳县和三门峡市卢氏县5 个产区的C3F 进行非靶向代谢组学分析,探索不同产区烟叶的关键差异代谢产物差异,旨在更好地指导烟叶生产和工业调拨。

1 材料与方法

1.1 试验样品

试验对象为河南省驻马店市泌阳县、南阳市社旗县、信阳市罗山县、洛阳市宜阳县、三门峡市卢氏县5 个产区2021 年的C3F 样品(表1),把刚调制完下炕的烟叶样品立即放入液氮中冷冻,样品邮寄到北京诺禾致源科技股份有限公司实验室,-80 ℃冰箱中储存备用。

表1 样本详情

1.2 试验仪器

本试验委托北京诺禾致源科技股份有限公司检测。Q Exactive™HF-X 质谱仪、Vanquish UHPLC 色谱仪,德国赛默飞世尔科技公司;Hypesil GOLD Column 色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.9 μm),美国赛默飞世尔科技公司;D3024R 型低温离心机,美国Scilogex品牌。甲醇、甲酸、醋酸铵均购于美国赛默飞世尔科技公司,超纯水购于德国Merck 公司,以上试剂纯度均为色谱级。

1.3 试验设计

本项目基于液质联用(LC-MS)技术进行非靶向代谢组学研究,试验设计主要包括样本的代谢物提取、LC-MS/MS 检测以及数据分析等。由于同一种代谢物可能带正电荷或者负电荷,所以分别对带正电荷和负电荷的代谢物进行检测和分析。

1.4 数据处理与分析

首先将质谱检测得到的原始文件(.raw)导入Compound Discoverer 3.1(CD)软件进行谱图处理及数据库搜库,得到代谢物的定性定量结果,然后对数据进行质控,保证数据结果的准确度、可靠性。再对代谢物进行多元统计分析,包括主成分分析(PCA)、偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)等,揭示不同组别代谢物的差异。利用层次聚类(HCA)和代谢物相关性分析,揭示样本之间及代谢物之间的关系。最后,通过代谢通路等功能分析解释代谢物相关的生物学意义。

2 结果与分析

2.1 各区域C3F 等级烟叶代谢组的多元统计分析

为了探究C3F 代谢物在泌阳县、社旗县、罗山县、宜阳县和卢氏县的区域特征,对烘烤后的烟叶进行代谢组测序和分析。正离子代谢物和负离子代谢物的主成分分析结果如图1 所示。由图1 可知,5 个地区间的烟叶代谢物特征差异明显,但各地区内部样本差异较小,且分离趋势均处在95%置信区间内。比较5 个地区发现,泌阳县和社旗县的烟叶代谢物主成分比较相近,宜阳县和卢氏县的烟叶代谢物主成分比较相近,而罗山县与其他地区的烟叶代谢物主成分相对差异较大。

图1 带正电荷代谢物(a)与带负电荷代谢物(b)主成分分析结果

2.2 主要代谢物及各区域特异代谢物表达分析

基于所有代谢物的表达丰度数据,利用单因素方差分析对样本组间进行差异比较,按照标准差(s)进行排序,以P<0.05 为阈值,对代谢物进行差异表达的筛选,得到各区域差异表达代谢物数量(表2),泌阳县、社旗县、罗山县、宜阳县和卢氏县的差异代谢物分别为477、411、319、186 和227 种,其中差异代谢物为正离子代谢物和负离子代谢物总和。图2 为差异表达代谢物可视化热图,由图2 可以看出,泌阳县和社旗县的差异代谢物的丰度比较相似,宜阳县和卢氏县代谢物比较相似(黑框标识)。基于差异代谢物丰度,通过皮尔森相关性分析(表3)发现,泌阳县和社旗县、宜阳县和卢氏县烟叶代谢物相关性较高(P<0.05)。

图2 差异表达代谢物丰度可视化结果

表2 各区域差异表达代谢物数量(单位:种)

表3 各区域烟叶代谢物皮尔森相关性分析

基于以上差异分析的结果,得到前20 种差异表达正离子代谢物(表4)和前20 种差异表达负离子代谢物(表5)。其中前20 种差异表达正离子代谢物包括14 种酸,分别为DL-色氨酸、葡萄糖酸、柠檬酸、L-苏糖酸、琥珀酸、水杨酸、富马酸、D-α-羟基戊二酸、2R-2,3-二羟基丙酸、DL-4-羟基苯乳酸、柠康酸、2-羟基己酸、N-乙酰基-D-别异亮氨酸和N-乙酰-DL-丙氨酸;1 种亚胺;1 种酚;1 种醇;1 种酰胺和2 种内酯。前20 种差异表达负离子代谢物包括7 种酸类,3 种碱,2 种酮等物质。

表4 前20 种差异表达正离子代谢物

表5 前20 种差异表达负离子代谢物

图3 为葡萄糖酸、L-苏糖酸、富马酸、D-甘露醇、D-谷氨酰胺、N-乙酰基-D-别异亮氨酸的丰度柱状图。通过L-苏糖酸和富马酸的丰度图可以看出,其在泌阳县和社旗县的丰度比较相近。结果支持本文前述猜想。

图3 6 种差异代谢物丰度

2.3 基于KEGG 数据库的代谢通路分析

为确定5 个区域C3F 等级烟叶差异代谢物的主要生物学功能,对这些差异代谢物进行了KEGG 通路富集分析(以P≤0.05 为阈值),如图4 所示。结果表明,差异代谢物主要富集在氨基酸代谢相关通路中。图5 以三门峡市卢氏县C3F 等级烟叶为例,色胺酸代谢通路表达差异最显著,该条代谢通路富集到的差异代谢物为吲哚和吲哚酚,主要集中在吲哚和吲哚酚生物合成上(图6)。

图4 KEGG 通路富集分析

图5 三门峡市卢氏县C3F 等级烟叶KEGG 富集气泡

图6 富集差异代谢物代谢路径

3 结论

1)泌阳县和社旗县烟叶代谢物相关性比较高,宜阳县和卢氏县相关性比较高,罗山县与其他区域代谢物均相差较大。可见地理位置相近,气候相近,代谢物相关性高;地理位置远,气候相差较大,代谢物相关性低。

2)KEGG 富集结果显示,差异代谢物主要富集在氨基酸代谢相关通路中。以三门峡市卢氏县C3F等级烟叶为例,以色氨酸为底物合成吲哚和吲哚酚生物合成途径是三门峡市卢氏县C3F 等级烟叶差异最显著的代谢途径。

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