小儿柴桂退热口服液治疗冠状病毒感染的网络药理学研究

刘 佳，曹文轩，黄 剑，秦瑞瞳，李丽静，于 澎

（1.长春中医药大学药学院，长春 130117；2.东北师范大学药物基因和蛋白筛选国家工程实验室，长春 130117；3.华东理工大学生物工程学院，上海 200237）

冠状病毒（Coronaviruses, CoVs)是广泛存在于自然界的是一种有包膜的单链RNA 病毒，被国际病毒学分类委员会分为α、β、γ 和δ，共4 个属[1]。 冠状病毒的广泛分布，人—动物转化和基因材料的频繁重组可能是导致冠状病毒在人类中频繁和周期性出现的原因[2-4]。 作为一种人畜共患病毒，它极大的威胁了人类和动物的安全。 目前已明确7 种CoVs 可使人类感染， 包括HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV 和SARS-CoV-2[5]。 其中2002年的SARS - CoV 和2019年肆虐全球的SARS-CoV-2 的感染人数和死亡人数令人痛心。

研究表明，1～3 岁的幼儿是冠状病毒的感染重灾区，但多为轻症，主要为呼吸道感染，也存在肺外表观。 其中HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1 每年均会引起大量感染，且儿童感染频率高于成人[6,7]。也有报道称HCoV-HKU1 可能诱发幼儿急性哮喘的发作[8]。 自SARS- CoV-2 感染爆发至2022年大部分地区实施常态化管理后， 儿童感染后多系统炎症综合征导致病症较明显，因此不能忽视儿童感染CoVs 所带来的潜在风险[9]。

中医药在防治CI 的工作中扮演着重要的角色，结合冠状病毒所引发的致病特点和临床症状，CI 病灶主要集中在肺部，属于“瘟病”范畴，以“湿、热、毒、瘀、虚”为主要病机[10]。 小儿柴桂退热口服液（Xiaoer Chaigui Tuire Oral Liquid，XCTOL）是近年来在临床应用较多的一种纯中药制剂，该药物对SARS-CoV-2 变异株儿童感染者引起的发热、头痛、咳嗽，黄鼻涕等症状效果良好[11,12]。 临床研究表明，XCTOL 能有效对抗病毒感染，提高机体抵抗力，增加合并用药的治疗效果，缩短临床治疗时间[13]。

网络药理学被认为是一种用于探究中药复方作用机制和开发新药的创新方式[14]。 分子对接技术也是新药结构分子生物学和计算机辅助药物设计的重要途径。 本研究利用网络药理学和分子对接技术探究XCTOL 中的活性化合物，预测其对抗CI 的潜在机制，探索其活性化合物与关键作用蛋白的对接关系[15,16]。结合对XCTOL 以往的研究， 本文将应用网络药理学结合分子对接的方法探讨XCTOL 对CI 的治疗靶点以及起到治疗效果的主要成分。

1 资料与方法

1.1 XCTOL 活性成分筛选

利用中药系统药理学数据库与分析平台[17]（TCMSP，https://tcmsp-e.com/）对XCTOL 中所含中药进行对应活性成分检索，包括柴胡、桂枝、葛根、浮萍、黄芩、白芍、蝉蜕。 以口服生物利用度(OB)≥30%及类药性(DL)0.18 作为筛选条件，构建XCTOL 活性成分数据库。

1.2 XCTOL 活性成分靶点预测

利用Pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库对XCTOL 组方中活性成分化学信息进行检索，从中获得SMILE 号，将SMILE 号导入SwissTarget Prediction 靶点预测平台，设置种属为“homo sapiens”，进行靶点预测，将得到的靶点进行整合和去重处理。

1.3 冠状病毒疾病靶点检索

以“Coronavirus”为检索关键词，利用Genecard 数据库对冠状病毒疾病靶点进行检索，将得到的靶点进行整合和去重处理。

1.4 交集靶点筛选及Venn 图绘制

在Venny2.1.0 平台分别录入XCTOL 和CoVs 的对应靶点，得到两者的交集，作为XCTOL 治疗CoVs的潜在作用靶点，并将其进行可视化处理。

1.5 中药-成分-靶点网络构建

将XCTOL 中活性成分及其预测的靶点、 疾病靶点和中药分别导入Cytoscape3.7.2 软件中， 构建 “中药-成分-靶点”网络，并进行可视化处理，其中中药、活性成分、靶点交集和非靶点交集分别用不同的形状和颜色表示。

1.6 蛋白-蛋白相互作用网络（PPI）构建

将XCTOL 与CoVs 的交集靶点输入至STRING（https://cn.string-db.org/） 平台， 设置种类为“Homo sapiens” 获取蛋白相互作用信息。 将作用结果导入至Cytoscape3.7.2 软件中进行可视化处理并进行拓扑分析，根据Degree 值的大小进行排序，筛选出核心靶点。

1.7 富集分析

选取XCTOL 与CoVs 的交集靶点， 利用DAVID（https://david.ncifcrf.gov/） 数据库对其进行GO（gene ontology）和KEGG 通路分析，分析XCTOL 抗CI 的生物过程和信号通路。

1.8 分子对接分析

利用Pubchem 数据库下载XCTOL 中活性化合物SDF 格式的3D 结构，利用Open Babel 软件将其转换为pdb 格式。 利用PDB（https://www1.rcsb.org/）数据库检索并下载蛋白质小分子的晶体结构， 运用Autodock 1.5.6 软件分别对化合物及靶蛋白进行加氢及加电荷处理，保存为pdbqt 格式。 将保存后的靶蛋白作为受体，化合物作为配体，在Autodock 1.5.6 软件进行分子对接， 对接的结果以结合能Binding Energy给出，以pdbqt 格式保存，Pymol 软件将结果进行可视化。

2 结果

2.1 XCTOL 活性成分筛选

通过数据库检索和筛选得到XCTOL 中活性化合物共74 个（共有成分4 个），其中柴胡13 个，桂枝3个，葛根4 个，浮萍6 个，黄芩32 个，白芍8 个，蝉蜕8 个。 XCTOL 中部分活性化合物基本信息见表1。

2.2 “中药-成分-靶点”网络构建与分析

该网络共有975 个节点， 其中包含7 个药物节点、79 个活性成分节点和889 个靶点节点，共有7332条边。其中中心圆形代表药物，外周圆形代表化合物，青色方形代表靶点，红色方形代表共有成分，每条边表示节点之间的相互作用关系，详见图1。 对构建后的网络进行拓扑分析，结果表明，包括β-谷甾醇、槲皮素、谷甾醇、山奈酚和芍药苷在内的60 种活性化合物的Degree 值大于100，说明这些化合物与超过100个疾病靶点之间形成相互作用， 这些可能是XCTOL作用与新冠病毒的主要物质基础。随后对网络图进行拓扑分析， 根据Degree 值排名筛选出排名前五的化合物，作为关键化合物。

图1 XCTOL-活性成分-靶点网络

2.3 XCTOL 治疗COVID-19 的潜在作用靶点

通过Genecard 数据库检索到冠状病毒相关靶点1650 个， 与XCTOL 靶点进行映射后获得交集靶点169 个， 以上结果运用Venny 平台进行可视化处理，详见图2。

图2 XCTOL-冠状病毒作用靶点示意图

2.4 蛋白-蛋白互作网络分析

PPI 网络图显示该网络共有136 个节点和1874条边，平均Degree 值为27.55，图中节点大小与Degree值成正比关系，节点的Degree 值越大，图中显示的节点越大。 Degree 值代表了蛋白与蛋白之间作用的强弱，作用较强的蛋白可能在生物学功能中发挥着重要作用。 其中PPI 网络中Degree 值排名前5 的蛋白为肿瘤坏死因子（TNF）、血清白蛋白（ALB）、肿瘤抑制蛋白p53（TP53）、胱天蛋白酶3（CASP3）和血管内皮生长因子A（VEGFA），这些靶蛋白可能是XCTOL 发挥抗冠状病毒作用的关键靶点，详见图3。

图3 XCTOL 治疗冠状病毒的靶点PPI 网络

2.5 富集分析

通过DAVID 数据库对XCTOL 与CoVs 交集靶点进行富集分析， 选取富集显著性排名前10 的GO 分析结果进行整理， 包括BP、MF 和CC 条目共30 个，详见图4。其中BP 主要涉及调控蛋白质磷酸化、正向基因表达、 炎症反应和DNA 损伤的内在凋亡信号等过程；CC 主要定位于细胞质、细胞膜、细胞外间质、细胞表面和胞质核周区等位置；MF 主要涉及调控蛋白结合、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、酶结合、ATP 结合及蛋白激酶活性等方面。

图4 GO 生物功能分析

通过DAVID 数据库对XCTOL 与冠状病毒交集靶点进行KEGG 通路富集分析， 选取P 值排名前20的通路进行整理和分析，详见图5。 主要富集在HIF1信号通路、PI3K-Akt 信号通路、VEGF 信号通路、TNF信号通路、流感和肝炎病毒等信号通路。

图5 KEGG 通路分析

2.6 分子对接分析

选取XCTOL 中关键化合物分别与PPI 分析中的关键靶点进行分子对接，结合能（Binding Affinity）小于0 说明化合物与靶蛋白之间具有对接活性，选取对接活性最佳的化合物和蛋白对接结果进行可视化分析， 详见图6。 小分子beta-sitosterol (β-谷甾醇)和stigmasterol（豆甾醇）与配体蛋白的对接活性高于其他小分子。

图6 分子对接能量热图和分子蛋白之间详细对接位点（C1:beta-sitosterol ;C2:kaempferol;C3:paeoniflorin;C4:quercetin;C5:stigmasterol）

3 讨论

CoVs 是自然界中存在较为广泛的一类病毒，研究表明CoVs 会导致人和动物的呼吸道、 消化道和神经系统相关疾病[18]。 当细胞遭受HCoV-229E 病毒感染后，几乎会出现细胞因子风暴相关炎性因子大量分泌现象，进而出现病毒感染症状[19]。 CoVs 入侵细胞还可能会“劫持”自噬途径，利用自噬膜结构特点促进自身复制，加剧CI 症状[20]。 其中不同类人群感染CoVs的严重程度亦有区分， 例如新生儿和有基础病感染SARS-CoV-2 的重症率、死亡率更高[21]，儿童相比于成人感染HCoV-229E 有可能引起严重的呼吸道感染症状[22]。 但是，并不是所有的药物都适用于儿童，例如美国FDA 在2021年先后批复包括巴尼韦单抗、埃特司韦单抗等在内的用于预防或治疗SARS-CoV-2 的药物[23]，目前只能用于部分成人及12 岁以上的儿童。目前，中医药治疗CI 在全国各地得到了广泛应用，例如XCTOL 作为纯中药制剂， 用于治疗流感病毒导致的肺炎等症，值得深挖和推广。

本研究从XCTOL 中筛选出5 个关键活性成分—β-谷甾醇（beta-sitosterol）、豆甾醇（Stigmasterol）、槲皮素 （quercetin）、 山奈酚 （kaempferol） 和芍药苷（Paeoniflorin）。 利用分子对接技术将以上关键成分与PPI 分析中的关键靶点蛋白进行对接，结果表明β-谷甾醇和豆甾醇与靶蛋白的亲和力较强。 这提示β-谷甾醇和豆甾醇可能在XCTOL 治疗CI 中发挥重要作用。 β-谷甾醇和豆甾醇同属于植物甾醇—一类曾被誉为“生命钥匙”的天然产物，具有抗氧化，免疫调节和抗炎作用等[24]。 其中，β-谷甾醇可以通过抑制炎症小体NLRP3 的激活抑制casp1 的产生以及MAPK 信号通路的激活，从而抑制TNF-α，白介素-1β，6，8 的分泌起到抗炎作用[25]。 豆甾醇可以抑制多种炎症介质和基质的降解， 通过阻碍IL-1β 诱导的NF-κB 通路来发挥其抑制炎症， 还可以明显减少炎症环境中COX-2 和iNOS mRNA 的表达发挥抗炎作用[26,27]。

KEGG 通路分析显示，XCTOL 与CI 共有靶点主要富集在HIF1 信号通路、PI3K-Akt 信号通路、VEGF信号通路、TNF 信号通路、 流感和肝炎病毒等信号通路。 HIF-1 信号通路参与不依赖O2的能量生产和血管生成(如VEGF)及红细胞生成，从而增加组织的氧气输送[28,29]。 CI 患者通常表现出B 淋巴细胞水平降低，这可能与HIF-1 激活有关[30]。 缺氧和HIF-1 信号的激活削弱了IgG 抗体的产生， 同时HIF-1α 操作B细胞Ig 同型变异， 影响了二次免疫的过程， 导致SARS-CoV-2 患者免疫过程受阻[31]。 PI3K-Akt 信号通路在调控炎症细胞激活和传递素释放过程中起重要作用，是呼吸道慢性炎症发生过程中的关键调节路径[32]。有研究表明，SARS-CoV-2 刺突通过细胞内ROS 抑制的PI3K/AKT/mTOR 轴诱导自噬， 进而导致受感染细胞的炎症反应和凋亡[33]。 VEGF 是一种强有力的血管通透性因子， 在SARS-CoV-2 感染的肺组织中诱导血管渗漏，导致血浆外渗和肺水肿，进一步加剧组织缺氧[34,35]。有研究表明，SARS-CoV-2 患者的尸检中发现感染的肺泡组织中存在大量的外渗物质[36,37]，重症患者体内VEGF 水平显著升高[38]， 这提示发生了VEGF 诱导的严重血管效应。在SARS-CoV-2 诱导的细胞因子中，TNF-α 通过诱导炎症细胞死亡，在损伤重要器官中发挥作用。 临床研究表明抑制TNF 信号通路不会导致病毒的重复感染，这对患者而言是有益的[39]。

PPI 网络分析结果显示，除TNF 和VEGFA 之外，血清白蛋白（ALB）、肿瘤抑制蛋白p53（TP53）、胱天蛋白酶3（CASP3）作为XCTOL 发挥治疗COVID-19作用的关键靶基因也参与了调控过程。ALB 约占血清总蛋白的50%，其参与自由基清除、维持胶体渗透压的生物过程，是与营养状况和全身炎症反应密切相关的一项指标[40]。 同时ALB 是预测CI 严重程度的一项重要指标，当出现病毒感染时，患者基础代谢率较高，肝功能受损导致ALB 的合成受阻，ALB 表现出水平降低[41]。 TP53 基因与癌症的发生和发展密切相关，几乎所有的癌症都具有TP53 基因异常这一共同特征，其实质是基因突变[42]。 有研究表明，TP53 基因对猪的SARS-CoV-2 相关蛋白ACE2 受体蛋白具有组织和性别特异性调控作用[43]，同时有研究报道TP53 通过ACE2 在人体内降解抑制冠状病毒的复制， 并在猪的冠状病毒感染中可抑制猪体内干扰素介导的抗病毒免疫[44]。 CASP3 由启动因子caspase 激活，活化的CASP3催化许多细胞蛋白，在DNA 断裂、核坍塌、染色质凝聚等过程中发挥作用[45]。CI 患者由于病毒感染激发的氧化应激增加活性氧(ROS)的产生[46]，高水平的ROS产生可能启动细胞凋亡过程[47]，CASP3 会参与这一过程。XCTOL 以多靶点和多通路的方式调控CoVs 入侵机体后的多个生物过程，这可能是其发挥作用的潜在分子机制，也是未来相关药物设计开发的切入点。

综上所述，本研究采用网络药理学和分子对接技术相结合的手段， 筛选XCTOL 中活性成分与关键靶蛋白相互作用的关键活性成分和信号通路，表明其可能通过调控炎症反应和细胞间信号转导等过程控制病毒的进一步侵染，具有多成分组合与调控多种途径的特点。 本研究为XCTOL 应用于儿童感染CoVs 的治疗和临床推广提供了理论基础。