马唐生防真菌MA4的分离鉴定及其生物学特性

舒 攀，左 瑶，李建勇，蔡海林*，刘 敏*

马唐生防真菌MA4的分离鉴定及其生物学特性

舒 攀1，左 瑶1，李建勇2，蔡海林2*，刘 敏1*

（1. 湖南农业大学 植物保护学院，湖南 长沙 410128；2. 湖南省烟草公司长沙市公司，湖南 长沙 410011）

【目的】筛选防治马唐（）的生防真菌，挖掘其应用于杂草生物防治的潜力。【方法】采用组织分离法，从自然发病的马唐植株中分离出对马唐具有较强致病力的生防菌株，通过形态学观察、、、基因序列同源性比对及其系统进化分析确定其分类地位；利用单因素试验研究其生物学特性及整株生物测定法测定马唐生防真菌对几种常见杂草的侵染效果及对常见作物的安全性。【结果】分离得到的马唐生防真菌MA4被鉴定为藤仓镰刀菌（）；最适合MA4生长的培养基为PDA和PSA；最适合MA4生长和产孢的培养条件为：温度28～30 ℃，pH值6.0～8.0，黑暗培养；MA4对马唐鲜重防效较好，达到91.4%，对看麦娘、狗尾草和钻形紫菀的鲜重抑制率分别为63.8%、80.6%、69.4%；MA4对双子叶作物相对安全。【结论】藤仓镰刀菌MA4菌株对马唐等禾本科杂草防治效果较好，对双子叶作物较安全，具有开发成生物除草剂的巨大潜力。

马唐；藤仓镰刀菌；生物防治；生物学特性

【研究意义】马唐（）是一种主要为害玉米、豆类、棉花、花生等秋熟旱地作物的恶性杂草，严重影响作物的产量。化学防治是目前防治马唐的主要手段[1]，而随着化学除草剂的长期使用，也带来了诸如环境污染、农产品农药残留、杂草抗药性上升等负面影响。相对于化学除草剂，微生物除草剂具有环境友好、对作物安全性高、杂草不容易产生抗性等特点[2]，因此研究和开发微生物除草剂具有广阔的前景。【前人研究进展】植物致病微生物理论上来讲都有开发成为生物除草剂的潜力，但在实际研究与应用中，真菌被研究更多。目前已经有报道多种真菌具有被开发成为生物除草剂的潜力，如镰刀菌属（）、尾孢霉属（）、茎点霉属（）、交链孢菌属（）等[3]。罗文芳等[4]从自然发病番茄列当上分离得到了一株列当生防真菌交链格孢（）JTF001；吴兆圆等[5]报道了一株防除马唐的链格孢菌（）；张亚鑫等[6]分离得到了对稗属杂草具有强致病力的新月弯孢（）、尖角突脐蠕孢（）等10株生防菌株；钟加日等[7]分离得到了一株稗草生防菌新月弯孢菌（）NX2A；李健等[8-9]报道了用于防除稗草的露湿漆斑菌（）和防除马唐的厚垣孢镰刀菌（）；俞雯雯等[10]报道了一株具有杂草生防潜力的嘴突凸脐蠕孢菌（）；陆俞萍等[11]发现木贼镰刀菌（）、再育镰刀菌（）、狗尾草平脐蠕孢（）、间型弯孢（）和新月弯孢（）5种病原菌具有开发成防除茶园杂草生物除草剂的较好潜力；王伟等[12]从土壤中分离得到一株球孢白僵菌（），其对野燕麦具有较好生物活性。也有研究人员报道细菌可以用于杂草生物防治。Yang等[13]从海水中得到一株黏质沙雷氏菌（），发现其对马唐有较好的活性；李鑫等[14]进一步测定了黏质沙雷氏菌菌株对玉米田杂草的活性，发现其对玉米田杂草反枝苋、马唐、苘麻、牵牛、稗草、虎尾草均有一定的防除作用，对反枝苋和马唐效果最佳。【本研究切入点】马唐对常用化学除草剂抗药性水平急剧上升，因此开发环境友好的非化学除草剂方法，可为马唐的科学防控提供新的选择与参考。【拟解决的关键问题】本试验拟以田间自然发病的马唐植株为研究对象，采用组织分离法分离得到一株马唐生防真菌MA4，通过形态学观察、基因、微管蛋白基因和翻译延伸基因分析确定其分类地位，并研究其生物学特性，可为微生物除草剂的挖掘与应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试植物：马唐病叶采集自湖南农业大学耘园教学科研基地；马唐、牛筋草等杂草种子均为本实验室采集并保存；水稻、玉米等作物种子均购自隆平高科种业有限公司。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA)：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15～20 g，蒸馏水定容至1 000 mL；马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）：马铃薯200 g，蔗糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水定容至1 000 mL；燕麦琼脂（OA）培养基：燕麦片30 g，蒸馏水定容至1 000 mL；马唐汁液培养基（CAJ）：马唐汁液200 g，琼脂20 g，蒸馏水定容至1 000 mL；水琼脂培养基（WA）：琼脂20 g，蒸馏水定容至1 000 mL。

1.2 马唐生防真菌的分离与鉴定

1.2.1 马唐生防菌的分离与纯化 用无菌水将自然发病的马唐叶片漂洗干净，沿病健交界处剪成小块，将组织小块置于5%次氯酸钠溶液和70%乙醇溶液中分别进行表面消毒60 s和30 s，表面消毒后的马唐叶片组织用无菌蒸馏水漂洗3～4次以彻底清除组织表面残留的消毒剂，随后将马唐叶片组织块置于灭菌的培养皿内，于超净工作台内吹干。将吹干后的马唐叶片组织置于灭菌的PDA平板上，置于28 ℃恒温培养箱内培养，待长出真菌菌落后用灭菌的接种针挑取菌丝至新的PDA平板内，产孢后挑取单孢子进行纯化得到纯培养菌株，命名为MA4。将MA4回接至表面消毒的健康马唐叶片，观察发病状况，并从马唐叶片病健交界处再次分离病原菌，以验证柯赫氏法则。

1.2.2 形态学鉴定 将菌株MA4在PDA平板上培养7 d，期间观察并记录其菌落形态。同时用无菌水将培养基表面的分生孢子洗下，制成分生孢子悬浮液，显微镜下观察菌株 MA4的分生孢子形态；对照魏景超[15]编著的《真菌鉴定手册》对菌株MA4进行形态学鉴定。

1.2.3 分子生物学鉴定 采用真菌基因组DNA提取试剂盒提取MA4菌株基因组DNA，采用通用引物ITS4/ITS5，Bt2a/Bt2b和EF728F/EF986R分别对MA4菌株基因、微管蛋白基因（）及翻译延伸因子基因（）进行PCR扩增，PCR扩增产物经回收后将其送往上海生物工程有限公司进行测序。将测序所得序列登陆NCBI（national center for biotechnology information），通过GenBank中BLAST功能基因序列比对，根据比对结果选取合适序列，利用MEGA 7.0软件分别构建系统发育树。结合形态学鉴定和分子鉴定结果，确定MA4菌株的分类地位。

1.3 马唐生防菌的生物学特性

1.3.1 培养基对MA4生长的影响 用PDA培养基活化保存的菌株5 d后，在菌落的边缘打取直径为5 mm的菌饼，接种到各种供试培养基上，9 d后采用十字交叉法测量菌落直径，并用无菌水洗脱分生孢子，稀释后用血球计数板计数。

1.3.2 温度对MA4生长的影响 以PDA培养基为基础培养基，接菌后将温度条件设置为15，20，25，30，35 ℃，测定温度条件对菌株生长的影响，接菌9 d后，测定菌落直径及分生孢子数量。

1.3.3 pH值对MA4生长的影响 将PDA培养基灭菌后调制成不同pH值，设置的pH值为4，5，6，7，8，9，10，参照1.3.1的方法，25 ℃黑暗条件下培养9 d后，测定菌落直径和分生孢子数量。

1.3.4 光照对MA4生长的影响 以PDA培养基为基础培养基，接菌后光照条件设置为0 h/24 h，8 h/16 h，12 h/12 h，16 h/8 h，24 h/0 h共5个处理，测定光照条件对菌株生长的影响，接菌9 d后，测定菌落直径及分生孢子数量。

1.3.5 对常见杂草的抑制效果 将MA4接种于PDA平板培养基，25 ℃、黑暗培养9 d后，收集孢子并配制成浓度为2.0×108个／mL的孢子悬浮液（含0.03%的吐温80）。将孢子悬浮液喷施3～4叶期稗草、马唐和狗尾草等杂草植株上，28 ℃、黑暗保湿培养2 d后，持续光照培养，观察菌株的致病特性。以喷施0.03%吐温80的植株为对照，每个处理设置3次重复。14 d后测定杂草发病率，并计算MA4对不同杂草的鲜重抑制率。

发病率=（生防菌侵染杂草数/供试杂草总数）/供试杂草总数×100%（1）

鲜重抑制率=（对照组杂草鲜重-处理组杂草鲜重）/对照组杂草鲜重×100%（2）

1.3.6 对常见作物的安全性测定 将MA4菌株接种至新鲜PDA平板培养9 d，用无菌水清洗并收集分生孢子，将浓度为2.0×108个/mL的MA4分生孢子悬浮液分别喷施于3～4叶期的水稻、玉米、大豆等作物植株上。接种14 d后记录不同作物发病程度，并测定MA4分生孢子悬浮液对不同作物的鲜重抑制率。参考李永龙等[16]的方法，按以下标准记载发病程度：NS表示无症状（一直无病斑，植株正常生长）；LS表示有轻微反应（初期叶片分布零星斑点，14 d后鲜重不受抑制）；MS表示中等感病（叶面出现较多病斑，14 d后鲜重受到抑制）；SS表示严重感病（叶片病斑连成一体，14 d后鲜重受到严重抑制）。

1.4 数据分析处理

利用SPSS统计软件分析不同处理间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 马唐生防真菌的分离与鉴定

马唐生防菌MA4菌株在PDA平板上形成白色絮状菌落，菌丝紧密，菌落边缘规则。在培养初期形成椭圆形小型分生孢子，培养后期形成镰刀型大型分生孢子（图1）。根据形态学特征，将MA4菌株初步鉴定为镰刀菌。

图1 MA4菌落及分生孢子形态

将扩增得到的MA4菌株、、基因序列提交到NCBI数据库（序列号分别为MN088607，MN096557，MN096556），BLAST比对结果显示，MA4菌株、、基因序列与来自藤仓镰刀菌的基因序列MK192049、基因序列LT575105及基因序列KM514487的同源性分别为100%、100%、99%。基于、、基因序列构建的系统发育树（图2，图3，图4）均显示，MA4菌株与藤仓镰刀菌处于同一分支。结合形态学及分子生物学结果，将马唐生防菌MA4最终鉴定为藤仓镰刀菌（）。

图2 基于ITS基因构建的MA4系统发育树

图3 基于微管蛋白基因（β-Tubulin）构建的MA4系统发育树

图4 基于翻译延伸因子基因（EF-1α）构建的MA4系统发育树

2.2 培养基对MA4菌株生长的影响

菌株MA4在不同培养基上的生长情况如表1所示。由表1可知，MA4菌株在PDA培养基上长势较好，生长速度较快，培养9 d后菌落直径达到7.6 cm，在PSA培养基上的长势和生长速度次之，但与PDA培养基相比差异不显著；MA4产孢量方面，也以PDA培养基产孢效果最佳。

表1 不同培养基对MA4菌株生长的影响

2.3 温度对MA4菌株生长的影响

培养温度对菌株MA4生长的影响如表2所示。在PDA培养基上，MA4菌株在25，28，30 ℃条件下的菌落生长速度和产孢量均没有显著差异；当温度低于25 ℃或高于30 ℃时，菌落生长速度和产孢量均显著下降。

表2 温度对MA4菌株生长的影响

2.4 培养基pH对MA4菌株生长的影响

培养基pH对菌株MA4生长的影响如表3所示。在PDA培养基上，MA4菌株在培养基pH=7条件下的菌落生长速度和产孢量最高，但和pH=6及pH=8处理间没有显著差异；当培养基pH超过6～8区间时，菌落生长速度和产孢量均受到显著抑制，说明最适合MA4菌株生长和产孢的pH为6～8。

表3 培养基pH对MA4菌株生长的影响

2.5 光照时间对MA4菌株生长的影响

光照时间对菌株MA4生长的影响如表4所示。在PDA培养基上，光照时间长短对MA4菌株菌落生长速度没有显著影响，但对MA4产孢量影响较大，MA4菌株在黑暗条件下产孢效果最好，随着光照时间的延长，MA4产孢受到明显抑制。

表4 光照时间对MA4菌株生长的影响

2.6 致病广谱性测定

致病广谱性试验结果表明：禾本科杂草中，MA4分生孢子液对马唐的生防效果最佳，对马唐的鲜重防效达到91.4%；对狗尾草防效次之，为80.6%；阔叶杂草中，MA4分生孢子液对钻形紫菀鲜重防效69.4%，对小飞蓬、铁苋菜、酢浆草生长几乎没有影响。

表5 菌株MA4孢子液对不同杂草的抑制效果

2.7 作物安全性测定

作物安全性测定结果表明，MA4分生孢子液对水稻和玉米的鲜重抑制率分别为39.7%和28.6%，表现为中等感病；对辣椒、番茄等双子叶作物几乎无影响。

表6 菌株MA4孢子液对不同作物的安全性

3 讨 论

利用杂草致病微生物开发专一性强、对非靶标植物安全、环境兼容性好、安全性高的微生物除草剂，或利用杂草致病微生物的活性代谢产物开发微生物源除草剂，是当前杂草绿色防控技术体系的重要发展方向，符合可持续农业的发展要求。镰刀菌是一类世界性分布的真菌，可侵染多种植物，引起茎腐、根腐、叶斑在内的多种病害[17]。由于镰刀菌对营养要求不高，易于培养，发酵培养过长中易于形成大量分生孢子，因而被广泛地应用于杂草的生物防治[18]。

镰刀菌的鉴定非常复杂，传统的单一序列同源性分析鉴定该属真菌存在一定难度，一些相较于基因变异速率更快的保守基因片段（如、基因等）有助于精确鉴定镰刀菌[19]。李祥等[20]从患病甘草根部分离得到杂草致病菌株GD-0221，通过形态学特征及序列分析将其鉴定为尖孢镰刀菌（）。王亚娇等[21]从感病弯管列当分离得到一株生防真菌，结合形态学特征及翻译延长因子基因序列同源性分析，将其鉴定为尖孢镰刀菌（），该菌同时兼具良好的促生作用。Daniel等[22]从感病杂草分离得到具有除草活性的镰刀菌株，通过基因及翻译延长因子基因序列同源性分析将其鉴定为藤仓镰刀菌（）。本研究中综合利用、、等3个基因片段的同源性分析及系统进化分析，将马唐生防菌MA4最终鉴定为藤仓镰刀菌（），结果可靠性较高。

杂草生防菌虽然具备了被开发为杂草生防制剂的潜力，但其能否被开发为微生物除草剂登记产品还受诸多因素限制，如营养条件、环境因素等。王亚娇等[23]通过单因素试验和正交设计试验发现，列当生防菌层出镰刀菌Br-1在最优培养条件下产孢量得到大幅提升，显著提高了生防效果。杨莹等[24]通过中心组合设计优化了出芽短梗霉菌（）PA-2菌株的发酵条件，发现优化后的培养和发酵条件可有效提高PA-2菌株的产孢量，降低发酵成本。本研究结果显示，优化的培养条件可以显著提升马唐生防真菌MA4的产孢量。

生防菌株致病力和安全性是制约生物除草剂开发最关键的两大因素。本研究分离得到的马唐生防菌菌株藤仓镰刀菌MA4对包括马唐在内的几种农田禾本科杂草有广谱的除草效果，对禾本科作物有明显的侵染现象，而对阔叶作物表现相对安全，因此MA4菌株有被开发成阔叶作物田防除禾本科杂草生物除草剂的潜力。

在后续的生防试验中可通过生物除草剂制剂的制备以提高其生防效果稳定性，将其与低剂量禾本科杂草除草剂进行菌药混合施用扩大其杀草谱，进一步挖掘其生防潜力，在保障环境友好的基础上兼顾更高的防效。

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Isolation, Identification and Biological Characteristics of the Biocontrol Fungi MA4 for

SHU Pan1, ZUO Yao1, LI Jianyong2, CAI Hailin2*, LIU Min1*

（1. College of Plant Protection, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2. Changsha Branch of Hunan Provincial Tobacco Company, Changsha 410011, China）

To screen biocontrol fungi ofand explore the potential of its application in weed biological control.The biocontrol strains with strong pathogenicity towere isolated from naturally diseased plants by tissue isolation method, and their taxonomic status was determined by morphological observation, sequence homology comparison and phylogenetic analysis of,andgene. Biological characteristics of the biocontrol fungi was determined by single factor test. Infection effect on several common weeds and safety to common crops were also determined by whole plant bioassay.The isolatedbiocontrol fungi named MA4 was identified as. The most suitable media for MA4 growth were PDA and PSA.The most suitable culture conditions for MA4 growth and spore production were temperature of 28-30 °C, pH of 6.0-8.0 and dark culture.MA4 had good control effect on, the fresh weight control effect was 91.4%, and the fresh weight inhibition rates of,andwere 63.8%, 80.6% and 69.4%, respectively.MA4 is relatively safe to dicotyledonous crops.MA4 strain has good control effect on grasses such asand is safe to dicot crops, and it has great potential to be developed into a biological herbicide.

;; biological control; biological characteristics

10.3969/j.issn.2095-3704.2023.04.63

S476.1

A

2095-3704（2023）04-0418-07

2023-10-07

2023-10-22

舒攀（1998—），男，硕士生，主要从事杂草生物防治技术研究，1378314479@qq.com；*通信作者：刘敏，讲师，博士，liumin8637@hunan.edu.cn；蔡海林，高级农艺师，博士，hailincai@126.com。

舒攀, 左瑶, 李建勇, 等. 马唐生防真菌MA4的分离鉴定及其生物学特性[J]. 生物灾害科学, 2023, 46(4): 418-424.