壳聚糖及其衍生物在牙本质粘接修复中的研究进展

关岚曦,蔡 辰,黄雨婷,李 阳,江千舟

牙本质粘接修复时,磷酸或粘接剂中的酸性单体使牙本质发生脱矿。粘接剂树脂渗透进入蓬松多孔的三维胶原纤维网状结构中,包裹裸露的胶原纤维形成混合层,它为牙本质粘接提供微机械固位力[1]。混合层是决定牙本质粘接修复成败的重要因素,也是牙本质-树脂粘接界面的薄弱环节[2]。研究表明若粘接剂无法完全渗透进入脱矿胶原纤维网底部和胶原纤维的空隙内[3-5],裸露的胶原纤维在残留水分提供的湿润环境下,极易受到内源性蛋白酶的水解,使得混合层的完整性被破坏,导致微渗漏的发生[1,5],最终影响牙本质粘接的耐久性[6]。因此,近年来有学者提出利用外源性胶原交联剂进行牙本质生物改性。可以增强胶原纤维网机械性能,同时控制细胞外基质生物降解[7-9],提高牙本质-树脂粘接界面的耐久性。壳聚糖及其衍生物作为天然交联剂,被认为有助于提高牙本质-树脂间的粘接效果,具有良好的应用前景,为临床新材料研发提供了新方向。本文对壳聚糖及其衍生物其在牙本质粘接修复中的作用及其改善牙本质粘接效果的作用机制作一综述。

1 壳聚糖及其衍生物的特性

1.1 分子特性及溶解性

壳聚糖(聚-2-氨基-2-脱氧-8-D-葡萄糖)是一种天然直链多糖,由甲壳素脱乙酰而得。甲壳素源于甲壳动物外壳、昆虫表皮和真菌细胞壁[10-11],是自然界中仅次于纤维素外最广泛存在的生物聚合物[12],具有低成本、低细胞毒性等特点[13]。脱乙酰度和分子质量(molecular weight,MW)是影响壳聚糖生物活性的重要因素,脱乙酰度越大或分子质量越小,则壳聚糖的生物活性越强且水溶性越大[12,14]。由于壳聚糖微溶于水而易溶于有机酸,临床常用醋酸溶液溶解壳聚糖[12]。

壳聚糖含有易发生化学反应的活性官能团,对壳聚糖进行化学改性可以得到壳聚糖衍生物[15]。常见的壳聚糖衍生物包括季铵化壳聚糖、羧基化壳聚糖、酰化壳聚糖、糖酰化壳聚糖等[16]。通过对壳聚糖进行化学改性,引入功能基团或金属纳米粒子形成壳聚糖衍生物,可以改善壳聚糖的物理、化学性质,满足特定研究领域的特殊性能要求。如通过壳聚糖的羧甲基化而获得的羧甲基壳聚糖具有较高的pH敏感性、溶解性、可吸收性和可降解性,在药物控释过程中可用作高效的药物输送载体[16]。壳聚糖的氨基和羟基与有机酸或酸酐、酰氯等反应生成的季铵盐壳聚糖作为免疫增强剂可以促进体液免疫和细胞免疫,利用其制作的疫苗具有毒性低、安全性好的特点[17]。

1.2 螯合性能

壳聚糖及其衍生物具有良好的螯合性能[11],在酸性条件下对不同的金属离子(包括Ni2+、Zn2+、Co2+、Fe2+、Mg2+、Cu2+)具有较强的螯合能力,在不同领域中被用于金属离子的去除或回收[18]。壳聚糖的螯合性能主要依靠氨基上的氮原子与金属阳离子发生反应来体现。由于在弱酸或酸性环境下氮元素上的自由电子才可与金属离子发生反应[19],因此溶液的pH值会影响壳聚糖的可进行螯合作用的氨基数量,进而影响其螯合能力。壳聚糖与金属离子发生螯合作用的模式可分为:①“桥”模型,1个金属离子与壳聚糖多个氨基发生配位,其中氨基来自相同或不同聚合链的不同氨基葡萄糖单位;②“吊坠”模型,1个金属离子仅与1个壳聚糖氨基发生配位[19-20]。壳聚糖的螯合性能已在口腔医学领域得到应用,例如在根管预备时,壳聚糖可通过与羟基磷灰石中的钙离子形成络合物从而去除玷污层中的牙本质碎屑等无机组织[21]。Zhou等[22]研究表明,利用0.2%壳聚糖溶液进行根管冲洗可以去除根管内绝大多数的玷污层和牙体硬组织碎屑,使大部分牙本质小管口呈开放状态。

1.3 抑菌性能

壳聚糖及其衍生物具有良好的抑菌性能[23],对细菌、真菌、病毒等病原微生物具有广泛的抑菌活性[20,23-24]。壳聚糖及其衍生物的抑菌机制可能为:①静电作用,壳聚糖C-2位上的氨基在pH<6时带正电,可以通过静电吸引与带负电的细菌壁或细胞膜发生结合[13,25],导致细菌膜的渗透性和屏障性能受到损害,细菌内容物漏出而致死[10,26],同时可以阻断细菌与外界的物质交换通道,抑制菌体生长[27];②抑制RNA和蛋白质的合成,低分子质量的壳聚糖可以进入细胞内部与病原体的DNA或RNA结合,阻碍DNA的转录和蛋白质的合成,以此达到抑菌的效果[25-27];③金属离子螯合作用,具有螯合性能的壳聚糖及其衍生物可以与病原微生物细胞中的金属离子和营养物质中的微量元素发生螯合,抑制细胞的生长代谢[25-27]。

壳聚糖的抑菌性能和抑菌模式受到多重因素的影响。内源性因素包括:壳聚糖的来源、浓度、相对分子质量、脱乙酰度等。外源性因素包括:环境pH值、微生物的种类、温度等[20]。Gu等[28]的研究表明,1%高分子(MW>40 ku)壳聚糖对变异链球菌、放线菌和粪肠球菌的活性均有抑制作用。Stenhagen等[29]的研究表明,0.025%和0.050%的壳聚糖溶液均可减少变异链球菌生物膜的形成,且0.050%的壳聚糖溶液抑菌效果更强。Machado等[13]比较了壳聚糖及其一种衍生物(三氯生-壳聚糖)的抑菌效果,结果显示壳聚糖组未能减少菌斑生物膜的生成。这可能是由于该实验中壳聚糖以粉末形式直接加入粘接剂,而壳聚糖需要以有机酸作为溶剂以激活其氨基并发挥抑菌作用。三氯生-壳聚糖组在粘接即刻及6个月后均有良好的抑菌效果,且5%浓度组的抑菌效果明显优于2%组,表明三氯生-壳聚糖的抑菌效果可能与浓度有关。

体外实验已证实壳聚糖及其衍生物有较强的抑菌性能。然而其在临床实践中的可行性,即作为抑菌剂应用于牙本质粘接过程以减少或抑制继发龋发生,需要更多临床试验验证。

2 壳聚糖及其衍生物在牙本质粘接修复中的应用

2.1 作为牙本质粘接预处理剂

壳聚糖及其衍生物可以作为预处理剂,配合全酸蚀粘接系统或自酸蚀粘接系统进行牙本质湿粘接[30-31]、干粘接[28]或乙醇湿粘接[32]。壳聚糖及其衍生物溶液作为预处理剂,可以增强牙本质粘接强度[31],抑制牙本质内源性蛋白酶的活性[33],进而增强牙本质粘接界面的稳定性。然而,目前关于壳聚糖及其衍生物的使用浓度、预处理时间、冲洗方式等因素对临床效果的影响仍少见文献报道,其临床操作的流程及参数有待统一规范。

2.2 与粘接剂混合应用

壳聚糖及其衍生物也可以与全酸蚀或自酸蚀粘接剂混合使用,不影响临床常用的牙本质粘接修复流程,较为简易方便。Neves等[34]的研究表明,将壳聚糖纳米粒子加入粘接剂后,粘接强度没有出现明显的下降,且具有优异的抑菌性能和抑酶性能。Stenhagen等[29]研究表明,将壳聚糖的一种衍生物(丙烯酸甲酯壳聚糖)加入粘接剂中进行牙本质粘接修复,牙本质粘接强度与对照组差异无统计学意义,而将其加入复合树脂进行粘接后所得的粘接强度出现了明显下降。

3 壳聚糖及其衍生物改善牙本质粘接效果的机制

3.1 通过交联作用增强牙本质胶原纤维的机械性能

粘接过程中,牙本质脱矿会造成Ⅰ型胶原纤维的裸露,形成脱矿牙本质基质(demineralized dentin matrix,DDM),力学性能显著下降。若混合层未被树脂浸润,在咬合负荷下易被破坏,导致牙本质粘接修复的失败[35]。壳聚糖是一种天然化学交联剂,可与牙本质胶原纤维发生交联作用,即通过其富含的大量游离羟基与氨基和牙本质纤维产生纤维内或纤维间的共价结合[33]。形成的微纳米纤维交联网络可使处理后的胶原纤维的生物力学特性得到增强[33,36-38],同时,牙本质拉伸强度、断裂延伸率、弹性模量等物理性能得到提升,树脂-牙本质界面的寿命得到延长[39]。

Almeida Curylofo-Zotti等[40]研究表明,在激光或高速涡轮机处理后进行绿茶壳聚糖纳米粒子处理,可以使皮革样牙本质的显微硬度得到显著增强。Mohamed等[41]研究表明,壳聚糖纳米粒子的应用可以提升牙本质-树脂修复体的即刻微拉伸强度,且在粘接后3个月和6个月后均维持在较高水平。Paschoini等[31]研究表明,使用2.5%壳聚糖溶液作为预处理剂应用于全酸蚀粘接或自酸蚀粘接时,均可提升牙本质-树脂修复体的即刻微拉伸强度,且在粘接后6个月微拉伸粘接强度没有出现下降。然而,Baena等[30]研究表明,使用0.1%壳聚糖作为预处理剂应用于全酸蚀粘接或自酸蚀粘接时,牙本质-树脂修复体的即刻和热循环后的微拉伸强度相对对照组均没有出现提高。此种差异的出现可能与使用不同壳聚糖溶液浓度、溶剂及不同的粘接系统有关。

3.2 抑制内源性蛋白酶活性,增强牙本质胶原纤维的抗酶解性能

内源性蛋白酶主要以酶原的形式存在于矿化的牙本质基质中,当矿物质被酸性单体溶解时酶原会被激活[6,33]。内源性蛋白酶包括基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)和半胱氨酸组织蛋白酶(cysteine cathepsins,CC)。MMP和CC在牙本质基质降解中发挥重要作用[35,42],降低牙本质-树脂界面稳定性。因此,抑制MMP对胶原纤维的降解有利于提升牙本质混合层的完整性并减少微渗漏的发生[30],从而提高牙本质-树脂粘接界面的耐久性。壳聚糖可通过直接抑制内源性蛋白酶的活性或通过增强牙本质交联度间接避免内源性蛋白酶对牙本质-树脂界面的水解。壳聚糖及其衍生物抑制内源性蛋白酶的机制可能为:壳聚糖及其衍生物与酶的(非)催化区的氨基酸发生交联,引起酶的三维结构的不可逆改变,削弱酶识别和裂解底物的能力[30,33,43]。此外,在壳聚糖与牙本质胶原纤维形成分子内或分子间共价键时,胶原纤维分子间的交联度提高,使得胶原纤维与酶的结合位点被隐藏,阻碍了酶与牙本质胶原纤维的结合[6],从而提升了胶原纤维对酶解的抗性[2,31,38,43]。

有研究表明,0.1%的壳聚糖溶液在原位酶谱实验中展现出较强的牙本质内源性酶活性抑制能力;可抑制牙本质粉末中MMP-2和MMP-9的活性[33]。但也有研究发现,0.1%的壳聚糖溶液作为预处理剂应用在牙本质粘接时,MMP的活性没有得到明显的抑制,也没有改善即刻或热循环后的粘接强度[30]。导致该现象的原因可能是粘接系统中的酸性单体会重新激活内源性蛋白酶,或粘接系统与壳聚糖之间的相互作用削弱了壳聚糖的抑酶作用[30]。值得注意的是,交联作用的发生受限于牙本质胶原纤维特定的氨基酸种类和数量。当交联剂与全部特定氨基酸结合后,交联剂提升牙本质胶原纤维的机械性能和抗水解性能的作用会停止,而被激活的内源性蛋白酶仍可发生酶解作用[35]。壳聚糖集交联剂与胶原酶抑制剂的功效于一体,在交联作用失效后仍能保护胶原纤维不被胶原酶降解破坏,因而具有更广阔的应用前景。

3.3 大分子壳聚糖在选择性纤维外脱矿技术中的应用

纤维外脱矿技术是由Mai等[3]提出的新型牙本质粘接技术。其原理为:牙本质中的Ⅰ型胶原纤维具有分子筛效应,使得分子质量>40 ku的螯合剂无法进入胶原纤维内空隙[44]。因此,大分子螯合剂可以选择性地通过脱矿仅去除胶原纤维外的磷灰石晶体,从根本上避免了胶原纤维内晶体脱矿造成的MMPs激活及胶原纤维结构破坏[3,45-47]。多项研究证实高分子(MW>40 ku)壳聚糖或壳聚糖衍生物作为钙离子螯合剂可实现选择性纤维外脱矿,使胶原纤维保持直立蓬松的形貌并阻止混合层内MMP的暴露及活化[28,32,44,48]。此外,使用壳聚糖进行纤维外脱矿使干粘接的操作流程得以实现,从而进一步减少树脂水解及MMP活化的风险,避免粘接的技术敏感性问题[3]。

4 总结与展望

综上,壳聚糖及其衍生物因其具有良好的生物相容性、溶解性、抑菌性、螯合性及抑制内源性蛋白酶活性之作用,且其降解产物对人体无害,在医疗领域中的研究与应用日益广泛、成熟。壳聚糖及其衍生物可通过提升胶原纤维的机械性能、抑制酶解和抑制粘接界面细菌的活性达到提升牙本质粘接的效果。此外,大分子量壳聚糖及其衍生物可对牙本质进行纤维外脱矿,从而使牙本质干粘接成为可能。壳聚糖及其衍生物的临床应用效果受多种因素影响,如粘接系统、粘接流程的选择及壳聚糖衍生物种类、浓度、处理时间等。不同因素对其作用效果的影响仍需进一步研究以为临床实践提供参考。