1-脱氧-D-木桐糖-5-磷酸合酶（DXS）对枯草芽孢杆菌代谢途径的影响

李雁洁，韩 旭

1.苏州健雄职业技术学院，江苏 苏州 215411；2.沈阳化工大学，辽宁 沈阳 110142

萜类化合物在自然界中广泛存在且种类繁多，一些中草药中的有效成分及化妆品、食品工业、汽车工业等中的一些重要原材料都是萜类化合物。同时，萜类化合物有许多重要的生理功能，例如青蒿素及其衍生物被广泛应用于治疗疟疾[1]；紫杉醇是治疗癌症的有效药物[2]。随着科技的发展，社会对萜类化合物的需求日益增加，然而传统的天然提取方法和化学合成方法逐渐显现出多种弊端：成本高、产量有限、污染环境等。因此，利用微生物发酵法生产萜类化合物变得更有前景。

萜类化合物的生物合成依赖于代谢前体异戊烯基二磷酸（IPP）和二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP），而这两种物质的形成主要来源于两种代谢途径，一种是MVA 途径，另一种是MEP 途径。MVA 途径主要存在于大多数真核生物、古细菌和少数细菌中；而MEP 途径则主要存在于大多数细菌、植物叶绿体和藻类中[3]。MEP 途径包括七步酶促反应[4]，DXS 是参与第一步催化反应的关键酶，它以丙酮酸和3-磷酸甘油醛为底物，催化生成DXP（图1）。对细菌MEP途径的改造会影响与MEP 途径相关的各种产物的产量。据报道，芽孢杆菌属是微生物中异戊二烯产量最高的菌株[5]。有研究表明，在大肠杆菌中异源表达IspS 基因，并过表达dxs 和dxr 基因，可以促进异戊二烯产量的提升[6]。番茄红素产量的增加也可以通过改进大肠杆菌MEP 途径实现[7]。除此之外，还有关于通过改造MEP 途径提高青蒿素[8]、紫杉醇[9]、类胡萝卜素[10]等萜类化合物的报道。由此可见，DXS 的研究对于MEP 途径的改造、提高萜类化合物的产量至关重要。对MEP 途径中关键酶的研究不仅可以为改造MEP 途径奠定理论基础，也能为合成生物学和代谢工程生产萜类化合物提供有价值的理论支持。

图1 DXS 催化MEP 途径中的第一步反应

枯草芽孢杆菌遗传背景清晰，具有安全、无致病性的特点，是用来进行微生物发酵的首选宿主菌[11]。本次研究克隆了枯草芽孢杆菌MEP 途径的关键酶基因dxs，并将其与表达载体pHY-P43 相连接，构建出重组表达载体pHY-P43-dxs。之后，通过原生质体转化法将重组表达载体导入枯草芽孢杆菌中，并进行重组菌株的鉴定。最后，利用气相色谱-质谱法检测重组菌株相较于野生型菌株的气体释放成分及含量的变化。

1 材料与方法

1.1 实验材料

枯草芽孢杆菌168、大肠杆菌JM09、大肠杆菌DH5α：沈阳化工大学制药与生物工程学院生物工程实验室提供；T-vector PMD19：购自宝生物工程(大连)有限公司；pHY-P43 质粒：购自淼灵质粒平台。

1.2 实验方法

1.2.1 dxs 基因的克隆与重组表达质粒的构建

首先从枯草芽孢杆菌168 基因组文库中找到dxs 基因的碱基序列，设计引物。然后以提取的枯草芽孢杆菌的基因组为模板，PCR 扩增dxs 目的基因。根据pHY-P43 质粒上的多克隆位点选取BamH I和Bgl Ⅱ限制性核酸内切酶位点，将目的基因dxs与pHY-P43 质粒重组，再经过筛选、基因测序鉴定，最终获得重组表达质粒。

1.2.2 重组质粒转入枯草芽孢杆菌

将pHY-P43-dxs 重组质粒通过原生质体法转入枯草芽孢杆菌，并通过质粒提取与鉴定方法进行重组菌株的鉴定。

1.2.3 气相色谱-质谱联用分析

将野生菌株（对照菌株）与重组菌株（转入重组质粒的菌株）进行气相色谱-质谱分析。

2 结果与分析

2.1 实验结果

2.1.1 dxs 基因的克隆与重组表达质粒的构建

通过对比基因的测序结果，成功克隆并构建了含有dxs 目的基因片段的重组质粒，dxs 基因由1902个碱基对构成，编码633 个氨基酸。

2.1.2 重组质粒转入枯草芽孢杆菌

以野生菌为对照，通过对菌株的质粒提取以及双酶切、PCR 多项分子水平的鉴定，最终得到含有重组表达载体pHY-P43-dxs 的枯草芽孢杆菌重组菌株。

2.1.3 气相色谱-质谱联用分析

气相结果显示，野生型枯草芽孢杆菌样品瓶中气体的主要成分为二氧化碳和邻苯二甲酸异丁正壬酯，分别占气体总量的94.012%和5.988%。而含有重组表达载体pHY-P43-dxs 的枯草芽孢杆菌样品瓶中的气体成分全部为二氧化碳，且二氧化碳含量高于野生对照株。如图2 所示。

图2 气相色谱-质谱分析

2.2 分析与讨论

气相色谱-质谱分析结果表明，野生型枯草芽孢杆菌释放的气体主要成分为二氧化碳和邻苯二甲酸异丁正壬酯，而含有重组表达载体pHY-P43-dxs的重组菌株释放的气体仅有二氧化碳，且释放量增加。分析产生这个结果的原因可能是：生物体内的MEP 途径与其他反应途径（如TCA 循环）相互交叉，互相影响，互相制约。由于重组菌株内含有导入的重组表达载体pHY-P43-dxs，会引起重组菌株中dxs基因表达增加，从而引起MEP 代谢途径异常，会引起下游的生物合成反应的负反馈效应，不仅抑制了MEP 途径的下行，也促进了三羧酸循环，使得相应的呼吸和代谢能力随之增强。因此，二氧化碳排放量增加，邻苯二甲酸异丁正壬酯因代谢增强而消失。

该实验现象为首次发现，尚未有相关的研究报道，因此该研究可以为细菌代谢途径的分析和改造提供一定的理论基础和参考价值。