SALL4的促癌功能及治疗意义

杜琳琳 ， 谢飞 ， 马雪梅

北京工业大学环境与生命学部，北京 100124

婆罗双树样基因4（spalt-like transcription factor 4，SALL4）是锌指蛋白转录因子SALL基因家族（SALL1～SALL4）的新成员，与果蝇Spalt基因具有同源性［1］。在小鼠和人类的正常发育过程中，SALL4已被证实发挥着至关重要的调节作用［2］。SALL4不仅在维持胚胎干细胞多能性和自我更新方面发挥着重要的作用，且与遗传性疾病、血液系统肿瘤、生殖细胞肿瘤等多种恶性肿瘤密切相关。SALL4在多种肿瘤中异常高表达，与肿瘤的发生、增殖、迁移和侵袭关系密切［3］。通过抑制SALL4的表达可有效抑制肿瘤的增殖和转移，因此SALL4成为肿瘤治疗潜在的新靶标。本文主要阐述了SALL4的异常表达机制及其在肿瘤进展和肿瘤治疗中的价值。

1 SALL4 蛋白分子结构与功能

SALL4基因位于人类第20号染色体q13.13-q13.2，全长约18000 bp，由4个外显子组成［4］。通过选择性剪切2号外显子产生2种SALL4 mRNA—SALL4A和SALL4B。人类SALL4蛋白含有4个C2H2 （Cys 2 His 2）型锌指簇（ZFC）结构域，包括：N端1个C2H2锌指簇，中间2个C2H2锌指簇，C端1个锌指簇。SALL4A蛋白有4个锌指簇，而SALL4B经选择性剪切后其蛋白缺乏ZF2和ZF3锌指簇［4］。最新的研究发现，在正常胚胎干细胞（ESCs）和SALL4依赖的肿瘤中，SALL4蛋白分子的ZFC结构域通过结合特异性基因DNA序列调节其表达。例如，SALL4在ESCs中可以通过C2H2 ZFC4与短的AT-rich基序结合，维持多能性并抑制分化［5］；SALL4的C端ZFC与DNA结合，在侵袭性肝癌细胞中负调控组蛋白3赖氨酸9特异性去甲基酶家族的表达［6］。除了ZFC结构域外，SALL4蛋白的N端含有一个富含谷氨酰胺（Q）的区域，这是与不同亚型SALL家族成员形成二聚体结构所必需的。SALL4作为转录调节因子，主要定位于细胞核中，其在64～67氨基酸上有核定位信号（nuclear localization signal，NLS）［4］。

SALL4主要在胚胎发育期和干细胞中表达，在干细胞的干性维持、自我更新与多项分化潜能方面发挥重要作用。SALL4是维持早期胚胎发育的关键基因，SALL4缺失的小鼠在着床后不久就会死亡［2］。SALL4突变会导致Okihiro/dune-radial综合征和Holt-Oram综合征，这两种疾病都是常染色体显性遗传病，表现为眼睛、上肢、肾脏发育异常和先天性心脏缺陷［1，7］。研究表明，SALL4可以与Oct4、Nanog、Sox2等关键干性调控因子形成转录调控网络来维持ESCs的自我更新［8］；另一项研究发现，SALL4缺失的ESC在小鼠囊胚中自发分化，表明其在维持多能性方面至关重要［9］。除生殖细胞和造血干细胞外，SALL4在多数成人组织中的表达被沉默，但在许多恶性肿瘤中被重新激活［3］。

2 SALL4激活表达的分子机制

SALL4的表达水平受到转录、转录后、翻译后和表观遗传水平等多层次分子机制的调控。在转录水平，SALL4表达受多个转录因子调控。研究表明，转录因子CDX1和STAT3分别在乳腺癌和胃癌中激活SALL4的表达［10-11］。SALL4与转录因子Oct4、Sox2和Nanog可以形成一个相互连接的自动调节网络，在小鼠胚胎干细胞中调控彼此及自身的表达［8］。此外，SALL4启动子区含有TCF/LEF的结合位点序列，SALL4的表达可以被LEF1或TCF4E激活，这表明SALL4是典型WNT信号通路的靶标［12］。在胚胎干细胞中，BAF复合物占据SALL4启动子，表明BAF复合物也可能在肿瘤SALL4的激活表达中发挥调控作用［13］。

在转录后水平上，多个miRNAs可以调节SALL4基因的表达。miR-15a在SALL4mRNA的3'UTR中有一个结合位点，并在肝癌细胞中抑制SALL4［14］的表达。miR-16和miRNA-485-5p分别抑制胃癌和急性髓性白血病细胞中SALL4的表达［15-16］。其他多种miRNA对SALL4的调控作用见表1。

在翻译后水平上，SALL4受赖氨酸残基上的SUMO修饰。SALL4有4个SUMO修饰位点，SUMO修饰可以促进SALL4的活性［27］。研究表明，一种E3泛素蛋白连接酶TRIM21通过靶向SALL4B序列中的Lys-190残基参与核SALL4降解［28］。核受体结合蛋白1（nuclear receptor binding protein 1， NRBP1）通过负调控SALL4的表达降低乳腺癌细胞的迁移侵袭能力，促进细胞凋亡，增加对化疗药物的敏感性［29］。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor， EGFR）通过激活ERK1/2通路诱导SALL4的表达［30］。

在表观遗传水平上，SALL4启动子区CpG岛的异常低甲基化是其高表达的原因之一，位于SALL4TSS下游的CpG位点发生去甲基化时，使STAT3和OCT4结合，招募含有BRG1的染色质重塑复合物，并增加RNA聚合酶Ⅱ与SALL4染色质的关联，从而增强SALL4转录［31］。此外，用甲基化抑制剂处理B-ALL细胞可导致SALL4调控区去甲基化进而过表达［32］。

3 SALL4 在肿瘤中的促癌作用及分子机制

3.1 SALL4参与肿瘤发生

SALL4与肿瘤发生的关系最早是在研究白血病时发现的［33］。在正常造血过程中，SALL4在CD34+HSC/HPC群体中表达，而在成熟的血细胞中，SALL4的表达沉默。相反，SALL4在急性髓细胞性白血病（acute myelocytic leukemia， AML）和髓系白血病细胞系中重新表达。进一步研究发现，SALL4转基因小鼠模型的造血功能失调并出现骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome，MDS）样症状，最终发展为AML，这表明SALL4促进白血病的发生。此外，功能丧失研究表明，SALL4下调会导致白血病细胞凋亡，显著降低免疫缺陷小鼠的肿瘤发生能力，这表明SALL4对白血病细胞特性的维持至关重要［34］。Bmi-1是一种可以调节干细胞多能性的癌基因，SALL4可直接与Bmi-1启动子结合，增加内源性Bmi-1的表达，使白血病原始细胞获得干细胞特性，如自我更新和/或去分化，从而成为白血病干细胞（leukemia stem cells，LSCs）［33］。在黑色素瘤研究中也发现SALL4的重新表达，并且其表达是原发黑色素瘤形成所必需的［35］。此外，过表达SALL4能够促进体内移植瘤的形成，而抑制SALL4可降低乳腺癌细胞的体内致瘤性［36］。

3.2 SALL4维持肿瘤增殖，抑制肿瘤凋亡

在胃癌研究中发现，SALL4通过直接激活CD44的表达来促进胃癌的进展，而SALL4基因敲除可以抑制胃癌细胞的克隆形成能力，诱导细胞凋亡和细胞周期停滞在G1期，从而抑制胃癌细胞的生长［37］。还有研究发现，SALL4通过HK-2介导的糖酵解促进胃癌细胞的增殖［38］。此外，胃癌细胞中的SALL4特异性结合DANCR（anti-differentiation noncoding RNA）的启动子区域，上调其表达，并通过激活β-catenin信号途径来促进胃癌细胞的生长［39］。在胆管癌中，SALL4高表达组织中细胞增殖标志蛋白Ki67也呈现高表达，表明SALL4高表达是促进肿瘤增殖加快的重要因素［40］。此外，SOX2/SALL4轴通过上调Notch信号通路相关基因来维持食管鳞癌细胞的自我更新能力［41］。

3.3 SALL4促进肿瘤迁移、侵袭及转移

多项研究证实，SALL4与许多恶性肿瘤的迁移和转移密切相关。研究发现，SALL4的高表达与胃癌患者淋巴结转移密切相关［42］。干扰SALL4表达可显著抑制乳腺癌细胞的迁移侵袭，而SALL4的过表达增强了乳腺癌细胞的迁移和侵袭［36］。进一步研究发现，SALL4过表达可促进间质标志物Twist1、N-钙粘蛋白的表达，抑制上皮标志物E-钙粘蛋白的表达，从而诱导胃癌细胞发生上皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）。此外，SALL4还通过诱导Bmi-1和Lin28b促进胃癌细胞获得肿瘤干细胞特性，提示SALL4通过调节EMT和细胞干性在胃癌中发挥致癌作用［43］。还有研究报道，SALL4通过与组蛋白去乙酰化酶2相互作用，直接共结合侵袭性基因来负向调节黑色素瘤细胞的侵袭［35］。此外，SALL4在乳腺癌细胞中能够上调整合素基因ITGA6和ITGB1的表达，促进细胞迁移［44］。

3.4 SALL4改变肿瘤代谢途径

肿瘤细胞代谢重编程是恶性肿瘤的重大特征之一。正常细胞主要依靠线粒体氧化磷酸化获取能量，而大多数肿瘤细胞主要依赖于有氧糖酵解来满足其生物能量和合成代谢需求，即在氧气存在的情况下癌细胞也以糖酵解获取能量，又被称为Warburg效应［45］。研究表明，多种转录因子（c-Myc、HIF1α、p53、NF-κB、STAT3、TWIST1）通过直接调控糖酵解基因（如GLUT1、HK2、LDHA、PFK等）调节肿瘤有氧糖酵解过程［46］。而SALL4可通过直接或间接的方式调节这些转录因子或糖酵解关键酶基因的表达，从而参与肿瘤代谢调控。Kim等［47］证明SALL4通过促进异染色质蛋白1α （heterochromosomal protein 1α，HP1α）的泛素化，从而增加葡萄糖转运蛋白1（glucose transporter 1，GLUT1）的表达，促进糖酵解。此外，还有研究表明，SALL4基因敲除抑制了胃癌细胞的葡萄糖摄取、乳酸生成、乳酸脱氢酶活性、ATP水平和己糖激酶（hexokinase，HK）活性，降低了糖酵解基因和蛋白的表达［38］。然而，有研究发现SALL4依赖性肿瘤细胞没有表现出Warburg 效应，更倾向于以OXPHOS获取能量。ChIP-seq数据分析显示，SALL4与近50%的线粒体氧化磷酸化基因结合，以激活它们的转录，进而增加癌细胞的耗氧量、线粒体膜电位和ATP生成，从而驱动肿瘤的发生［48］。体内和体外试验表明，SALL4高表达的肿瘤对极低剂量的氧化磷酸化抑制剂更敏感［49］。

3.5 SALL4诱导肿瘤耐药性和放疗抵抗

肿瘤耐药是影响治疗效果的重要因素，研究发现，SALL4可促进多种癌症的化疗耐药性。SALL4可通过募集E3泛素连接酶CUL4B（cullin 4B）降解HP1α蛋白及染色质开放，上调Glut1基因表达，进一步促进糖酵解发生，增强肿瘤细胞DNA损伤反应和DNA修复能力，从而诱导化疗耐药［47］。在研究子宫内膜癌［50］时发现，SALL4可以通过上调其下游靶基因c-Myc和ABCA1的表达来诱导化疗药物卡铂的耐药性。相反，抑制SALL4可以增强癌细胞对抗癌药物（顺铂、卡铂和紫杉醇）的敏感性，例如下调SALL4可以通过AKT/mTOR信号通路恢复耐药肺癌细胞对卡铂的敏感性［51］。

放射治疗是肿瘤的主要治疗方式之一，其疗效受到内源性和获得性放射抗性发展的限制。研究人员对SALL4在放射抗性中的作用进行了探究，发现SALL4沉默增加了鼻咽癌细胞中辐射诱导的DNA损伤、细胞凋亡和G2/M阻滞，抑制p-ATM、p-Chk2、p-p53和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，促凋亡蛋白被上调。综上，SALL4可通过ATM/Chk2/p53途径及其与凋亡相关的下游蛋白诱导放射抗性［52］。

3.6 SALL4促进肿瘤血管生成

持续的血管生成是癌症的特征之一，既为癌细胞高度增殖提供氧气和营养，也为逃逸的肿瘤细胞扩散到继发部位提供通道［53］。考虑到SALL4和新生血管在肿瘤转移中的作用，SALL4可能与血管生成有关。但SALL4在血管生成中的作用研究较少，Sun等［54］研究发现SALL4通过靶向血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGFA）促进内皮细胞的生长，从而参与血管生成过程，而SALL4基因敲除抑制了内皮细胞中VEGFA水平和血管生成。在透明细胞肾细胞癌研究中发现，SALL4通过调控Akt/GSK-3β信号通路和VEGFA的表达发挥促肿瘤和血管生成作用［55］。

4 SALL4在肿瘤诊断中的价值

SALL4在多种实体瘤和血液系统肿瘤中表达上调，如生殖细胞肿瘤、肝癌、结肠癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、胶质瘤、急性髓细胞白血病和慢性髓系白血病。SALL4在胃癌组织中的表达水平较正常对照组织明显升高，并且SALL4的表达水平与淋巴结转移和TNM分期呈正相关。SALL4阳性胃癌患者预后差、生存期短，因此SALL4可作为胃癌的预后指标［42］。在肝癌患者的血清中也检测到高水平的SALL4蛋白表达，且血清SALL4水平高的肝癌患者预后不良，肿瘤复发率较高，总生存率较低，提示高水平血清SALL4是一种新的肝细胞癌预后生物标志物［56］。结直肠癌患者外周血中SALL4基因的表达水平显著升高，且与肿瘤侵袭深度和肿瘤分化程度显著相关，提示SALL4可作为早期结直肠癌筛查、诊断和预测的生物标志物，与癌胚抗原（carcinoembryonic antigen， CEA）标志物相比，SALL4对结直肠癌的诊断具有更高的敏感性和特异性［57］。在肺癌研究中发现，肺癌复发患者化疗前SALL4的表达水平明显高于未复发患者，表明SALL4可以作为肺癌患者辅助化疗后是否复发的良好指标［58］。SALL4在AML中的表达与疾病进展及患者治疗状态有关［33］，而与治疗敏感的AML患者相比，治疗耐药的AML患者SALL4表达水平较高［59］，因此，SALL4可作为AML的诊断和预后指标。

5 SALL4在肿瘤治疗中的价值

近年来，为了实现精准医疗的目标，分子靶向治疗癌症引起了广泛的关注。SALL4与肿瘤发生、进展、耐药和转移的功能表明，以SALL4为靶点可以有效地抑制癌细胞恶性特征［60］。目前，靶向SALL4的治疗策略主要从干扰SALL4与表观遗传复合体的相互作用、直接抑制SALL4的表达和药物重定位3个方面进行。

5.1 干扰SALL4与表观遗传复合体的相互作用

早期研究发现，SALL4主要通过聚集HDAC/NuRD复合物至抑癌基因PTEN的启动子区域来抑制其表达，进而促进多种肿瘤的发生发展。研究者们在此基础上设计出一种可与SALL4竞争结合NuRD复合物的12-AA多肽，这种多肽可以阻断SALL4与NuRD的结合，逆转其对PTEN的抑制作用从而诱发肿瘤细胞凋亡［61］。体外研究发现，该多肽抑制剂治疗可诱导高表达SALL4的多种肿瘤（尤其白血病、肝癌）细胞的凋亡及抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。后来的研究通过肝癌小鼠模型证实了抗SALL4多肽在治疗肝癌中的体内活性［62］。由于多肽在体内传递效率差，其临床用途受到限制。

另一方面，由于SALL4可以聚集HDAC/NuRD复合物，因此HDAC抑制剂被认为可以间接抑制SALL4。Yong等［63］通过Cmap分析发现HDAC抑制剂Entinostat是治疗表达SALL4癌症的潜在药物，可以靶向抑制SALL4B表达，发挥治疗肺癌的作用。为了扩大SALL4靶向治疗癌症的范围，一项研究［64］发现临床上使用的去甲基化药物如5-氮-2'-脱氧胞苷可以激活和/或上调SALL4，HDAC预处理能将SALL4阴性的肺癌细胞启动为SALL4阳性，使其对Entinostat治疗敏感。

5.2 直接抑制SALL4的表达

如表1所示，miR-16、miR-188、miR-219、miR-103、miR-33b、miR-195、miR-107等多种miRNA调控SALL4或被SALL4调控，因此，利用SALL4-miRNA相互作用可能是一种新的治疗途径。使用LIN28抑制剂阻断其对Let 7/miR-98的抑制，能降低SALL4的表达［65］。研究发现对SALL4表达产生负面影响的Entinostat通过上调miRNA-205起作用。在体内，SALL4表达降低导致细胞活力下降，凋亡增加［66］。利用脂质体和纳米颗粒等载体将SALL4特异性siRNA［36，51］或shRNA［37］传递到癌细胞靶向抑制SALL4的表达，从而使多种癌细胞的存活率降低，迁移和侵袭能力减弱及肿瘤生长减慢。研究发现，免疫调节药物IMiDs可诱导包括SALL4A在内的超过11种锌指蛋白的降解。沙利度胺作为一种IMiDs，通过与E3泛素连接酶中的Cereblon （CRBN）结合，能够促进ZFC2 C2H2结构域上SALL4A的泛素化和降解［67］。

5.3 药物重定位——抑制SALL4表达

药物重定位是指从现有药物中发现对SALL4有抑制作用的药物，也称老药新用，优点在于候选药物的结构、生物活性及安全性已知，降低了开发和临床试验的成本［60］。Tan等［49］采用高通量筛选方法从1597个合成化合物和21575个天然化合物中筛选出对SALL4有抑制作用的化合物，得分最高的是氧化磷酸化抑制剂寡霉素。寡霉素是ATP合酶抑制剂，在体内外对SALL4高表达肿瘤细胞均有抑制作用，提示氧化磷酸化抑制剂可能用于高水平SALL4肿瘤的治疗。此外，苦参碱和芹菜素、吲哚及其衍生物TFPHC等化合物已被证明可以抑制白血病细胞中SALL4的表达［68］。白花蛇舌草-半边莲组成药可以通过下调SALL4表达，抑制结肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭，进而诱导细胞凋亡［69］。

6 展望

转录因子SALL4在胚胎发育、干性维持和肿瘤发生发展起着重要作用。本文对SALL4自身表达的调控因素进行探索，包括形成转录因子网络、WNT信号通路的激活、miRNAs的转录后调控、SUMO修饰、泛素化修饰以及启动子区的低甲基化，都对SALL4在肿瘤中的异常表达起着关键作用。同时，本文也对SALL4发挥促癌功能的分子机制进行了汇总，SALL4通过基因转录和表观遗传水平调控参与肿瘤的发生、增殖和凋亡、迁移侵袭、肿瘤耐药、肿瘤代谢、血管生成等生物学行为，从而促进肿瘤的发生发展。具体来讲，SALL4通过调节DANCR、Bmi-1、CD44、HK-2、TGF-β、c-Myc和ABCB1等多种基因和Wnt/β-catenin、TGF-β/SMAD、EMT、糖酵解等多种信号途径促进肿瘤进展。此外，多项研究表明SALL4通过上调c-Myc、ABCA3、ABCG2等基因的表达和激活AKT/mTOR信号通路促进子宫内膜癌、急性髓系白血病和肺癌的耐药性。同时，SALL4通过促进糖酵解参与肿瘤的代谢重编程，但具体机制需要进一步研究。SALL4在免疫逃避等肿瘤其他特征中的作用研究较少，值得进一步探讨。SALL4在肿瘤组织和血清中高表达且与肿瘤患者生存期及不良预后显著相关，提示SALL4可能是肿瘤早期筛查、预后判断和治疗监测的潜在标志物。采取有效手段抑制SALL4的表达可能是一种新的抗癌策略，抑制SALL4的蛋白-蛋白相互作用和其上游miRNA，以及使用抗SALL4 siRNA、shRNA都可以靶向抑制SALL4的表达，从而抑制肿瘤细胞的增殖和转移。此外，氧化磷酸化抑制剂等现有药物也表现出对表达SALL4的肿瘤细胞有抑制作用。这一证据有力地支持了SALL4作为癌症诊断、治疗靶点的重要性。深入研究SALL4异常表达的机制和下游通路及靶向SALL4在肿瘤中的治疗效果以及临床转化，将为人类战胜癌症带来新的希望。