5-氨基乙酰丙酸采用醇质体包载前后的稳定性*

罗国平,闫梦茹,孟会宁,杨娅琳

(1.西安医学院 药学院,陕西 西安 710021;2.西安步长医药销售有限公司,陕西 西安 710021)

5-氨基乙酰丙酸(5-Aminolevulinic acid hydrochloride,5-ALA)是一种亲水性的小分子化合物,属于内源性活性物质,为第二代光敏剂,已广泛应用于肿瘤、痤疮及病毒性和炎症性疾病[1-4]。5-ALA稳定性较差,温度、光照和介质pH均会对其稳定性产生影响[5],特别是在碱性条件下,可自发不可逆的降解而失去药理作用;另外,5-ALA为亲水性药物,经皮和黏膜的渗透性较差,这些缺陷限制了5-ALA的临床应用。基于此,采用醇质体包载5-ALA。醇质体是由磷脂、水和高浓度醇组成的具有囊泡结构的新型脂质体[6-8],水溶性药物包载于醇质体的内水相,除可增加药物的脂溶性,提高透皮和透黏膜的性能外,还可提高药物的稳定性[9-10]。作者主要对5-ALA采用醇质体包载前后的稳定性变化进行对比分析和研究。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

5-氨基乙酰丙酸盐酸盐：纯度99%,上海麦克林生化科技有限公司;大豆卵磷脂：药用级,磷酸二氢钾、磷酸：分析纯,乙腈：色谱纯,天津市科密欧化学试剂有限公司;胆固醇：药用级,东巨荣生物工程有限公司;无水乙醇、1,2-丙二醇：分析纯,天津永晟精细化工有限公司;氢氧化钠：分析纯,天津市化学试剂公司;甲醇：色谱纯,天津市大茂化学试剂厂。

高效液相色谱仪：Agilent Tech.1260,美国安捷伦科技有限公司;集热式恒温加热磁力搅拌器：DF-101S,巩义市予华仪器有限责任公司;电子天平：BT125 d,赛多斯科学仪器(北京)有限公司;台式高速离心机：TG-1650-WS,上海卢湘仪离心机仪器有限公司;超声波清洗机：SB-5200DT,宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 5-ALA醇质体的制备

采用pH梯度-乙醇注入法[11-13],精密称取240 mg大豆卵磷脂和40 mg胆固醇,置于100 mL烧杯中,加10 mL无水乙醇超声溶解;在避光条件下,将5-ALA溶解于20 mL磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH=2.0)中,n=100 r/min搅拌下用注射器缓慢匀速注入到上述乙醇溶液中,继续搅拌10 min,加氢氧化钠溶液调至pH=7.4,再搅拌20 min,最后250 W、40 kHz超声处理3 min,即得。

1.2.2 HPLC法测定5-ALA的相对含量

1.2.2.1 溶液的配制

(1)ρ(磷酸二氢钾)=13.6 mg/mL(pH=2.0)溶液的配制

称取6.8 g磷酸二氢钾固体粉末,加纯化水溶解并定容至500 mL,磷酸调至pH=2.0,即得。

(2)对照品溶液的配制

精密称取5-ALA对照品20 mg,置于25 mL棕色容量瓶中,加ρ(磷酸二氢钾)=13.6 mg/mL(pH=2.0)溶液溶解并定容至刻度,摇匀,避光冷藏,即得。

(3)供试品溶液的配制

取1.2.1方法制备的5-ALA醇质体混悬液4 mL,n=15 000 r/min离心15 min,沉淀加入4 mL甲醇,250 W、40 kHz超声处理10 min,离心,上清液过0.45 μm微孔滤膜,取续滤液,即得。

(4)空白溶液的配制

按照1.2.1方法制备不含药物的空白醇质体,再按照1.2.2.1(3)方法进行操作,即得。

1.2.2.2 5-ALA吸收波长的选择

将5-ALA对照品溶液用紫外分光光度计在200～800 nm进行扫描。

1.2.2.3 色谱条件

色谱柱：Agilent 5 TC-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相：V(乙腈)∶V(磷酸二氢钾)=3∶97;柱温：25 ℃;波长：265 nm;流速：1 mL/min;进样体积：20 μL[14-15]。

1.2.2.4 专属性实验

分别取上述对照品溶液、供试品溶液和空白溶液注入液相色谱仪,记录色谱图。

1.2.2.5 线性关系考察

精密吸取对照品溶液0.25、0.5、1.0、2.0、3.0 mL,置于10 mL容量瓶中,用流动相稀释并定容至刻度,得到系列不同质量浓度的对照品溶液。精密吸取上述溶液20 μL注入液相色谱仪,记录峰面积,以峰面积(A)为纵坐标,质量浓度(ρ,mg/mL)为横坐标进行线性回归。

1.3 不同因素对原料药和醇质体中5-ALA相对含量的影响

1.3.1 介质pH

精密称取5-ALA对照品3份,置于10 mL棕色容量瓶中(用锡纸包裹),加pH=2.0、7.4、10.0的PBS溶液溶解并定容至刻度,t=0、6、12、24、48、72 h取样,测定介质中药物的质量并计算相对含量;将制备的醇质体分成18份,置于10 mL棕色容量瓶中(用锡纸包裹),用pH=2.0、7.4、10.0的PBS溶液中进行分散(每种介质各6份),t=0、6、12、24、48、72 h取样(每种介质每个时间点各取1份),按照1.2.2.1(3)方法处理,测定醇质体中药物的质量并计算相对含量,以药物的相对含量对时间作图。相对含量的计算见公式(1)。

相对含量=mt/m0×100%

(1)

式中：mt为t时样品中药物的质量,mg;m0为样品中药物的初始质量,mg。

1.3.2 温度

精密称取5-ALA对照品3份,置于10 mL棕色容量瓶中(用锡纸包裹),加pH=7.4的PBS溶液溶解并定容至刻度,t=25、37、43 ℃置于水浴锅中,t=0、6、12、24、48、72 h取样,测定介质中药物的质量并计算相对含量;将制备的醇质体分成18份,置于10 mL棕色容量瓶中(用锡纸包裹),用pH=7.4的PBS溶液进行分散,t=25、37、43 ℃置于水浴锅中(每种介质中各6份),t=0、6、12、24、48、72 h取样(每个温度每个时间点各取1份),按照1.2.2.1(3)方法处理,测定醇质体中药物的质量并计算相对含量,以药物的相对含量对时间作图。

1.3.3 光照

精密称取5-ALA对照品2份,置于25 mL无色容量瓶和棕色容量瓶中(后者用锡纸包裹),加pH=7.4的PBS溶液溶解并定容至刻度,自然光和避光条件下,t=0、6、12、24、48、72 h取样,测定介质中药物的质量并计算相对含量;将制备的醇质体分成12份,置于25 mL无色容量瓶中,加pH=7.4的PBS溶液进行分散,自然光和避光条件下(各6份),t=0、6、12、24、48、72 h取样(每个时间点各取1份),按照1.2.2.1(3)方法处理,测定醇质体中药物的质量并计算相对含量,以药物的相对含量对时间作图。

2 结果与讨论

2.1 HPLC法测定5-ALA的相对含量

2.1.1 5-ALA吸收波长的筛选

5-ALA对照品溶液的吸收光谱见图1。

λ/nm图1 5-ALA光谱扫描图

由图1可知,5-ALA在265 nm有最大吸收。

2.1.2 专属性实验

HPLC色谱图见图2。

t/min图2 HPLC色谱图

由图2可知,供试品溶液中5-ALA的色谱峰与杂质峰之间能得到很好的分离,且辅料对主药的测定无干扰,方法专属性良好。

2.1.3 线性关系考察

回归方程为y=66.41x+22.131,r=0.999 3,说明ρ(5-ALA)=0.103 5～0.798 4 mg/mL线性关系良好。

2.1.4 醇质体中药物的包封率测定

醇质体中5-ALA的包封率测定为85.21%,说明包封率较高[16]。

2.2 不同因素对原料药和醇质体中5-ALA相对含量影响的对比分析

2.2.1 介质pH

介质pH对原料药和醇质体中5-ALA相对含量的影响见图3。

t/ha pH=2.0

由图3可知,t=144 h、pH=2.0、7.4、10.0,原料药中5-ALA相对含量分别为40.1%、25.6%、13.3%,醇质体中5-ALA为49.3%、43.7%和36.0%。二者中5-ALA的相对含量均随着时间的增加而降低,且pH值越高,相对含量降低速度越快,说明5-ALA在酸性介质中稳定好,在碱性介质中易降解;pH值相同,醇质体中5-ALA的降解速度几乎均小于原料药中5-ALA的降低速度,且随着pH值的升高差异性越大,说明5-ALA被醇质体包载后稳定性有一定程度的增加,特别是在碱性介质中,可有效降低5-ALA的降解。

2.2.2 温度

温度对原料药和醇质体中5-ALA相对含量的影响见图4。

t/ha t=25 ℃

由图4可知,t=72 h,t=25、37、43 ℃,原料药中5-ALA相对含量为42.1%、28.9%和6.7%,醇质体中5-ALA为58.2%、37.0%和8.8%。在相同温度下,随时间的推移,二者的相对含量均下降,且随温度升高,5-ALA的降解速度呈加速趋势,t=43 ℃,5-ALA降解非常明显;对比分析原料药和醇质体中5-ALA降解情况,t=25、37 ℃有较大差异,且醇质体中5-ALA稳定性更好一些,t=43 ℃无显著差异,分析原因,醇质体的相变温度tm=40～42 ℃,由于25、37 ℃低于相变温度,醇质体能较好包载5-ALA,因此降解速度比原料药慢一些;43 ℃高于相变温度,醇质体发生破囊,包载其中的5-ALA将迅速释放到介质中并发生快速降解,其降解情况与原料药相似。

2.2.3 光照

光照对原料药和醇质体中5-ALA相对含量的影响见图5。

t/ha 避光

由图5可知,t=72 h,避光和自然光照射下的原料药中5-ALA相对含量为42.6%和30.5%,醇质体中5-ALA为56.7%和60.9%。在避光条件下,原料药和醇质体5-ALA的相对含量下降速度均略低于对应的自然光条件下的下降速度,说明光线对5-ALA有一定影响;不管是在避光还是自然光照射下,醇质体中5-ALA相对含量降低速度均低于原料药的下降速度,特别是在光照下,二者的差异更大,说明醇质体对光线具有较好的阻隔作用。

3 结 论

采用pH梯度-乙醇注入法制备高包封率醇质体,其具有热敏性,介质pH、温度和光线等因素均会影响5-ALA的稳定性,其规律为碱性条件下5-ALA更容易降解,温度越高降解速度越快,光照对药物的降解影响相对较小,5-ALA被醇质体包载后可降低介质pH、温度和光线等因素的影响,提高其稳定性。