海巴戟果实多糖的结构特征及体外抗氧化活性研究

王青芬, 敖新宇, 宫树森, 刘 琅, 刀 梅, 吴 田*

(1.西南林业大学 园林园艺学院;国家林业和草原局西南风景园林工程技术研究中心;云南省功能性花卉资源及产业化技术工程研究中心,云南 昆明 650224;2.西南林业大学 文法学院,云南 昆明 650224)

海巴戟(Morindacitrifolia)又称诺丽,学名海滨木巴戟,茜草科巴戟天属,原产于南太平洋诸岛,在我国分布于云南、海南等地区。海巴戟根、茎、叶和果实均可入药[1],用于治疗多种病症,如感染、关节炎和哮喘等[2]。2010年,海巴戟果浆被我国卫生部列入了新资源食品名单,其保健价值日益受到人们的关注。多糖是海巴戟中含量较高的一种活性成分。多糖是通过糖苷键连接形成的链状高分子碳水化合物,广泛存在于自然界中,其结构复杂多样,不仅是生物体的重要组成部分,还具有抗氧化[3]、抗衰老[4]、免疫调节[5]、抗炎[6]、抗肿瘤[7]等生物活性。沈晓静等[8]通过体外抗氧化实验测定咖啡花多糖对ABTS自由基、DPPH自由基的清除率以及Fe2+还原力,结果表明咖啡花多糖具有一定的抗氧化活性。王晓敏等[9]研究表明山药多糖的抗氧化活性显著高于Vc,具有较好的体外抗氧化活性。有研究指出,多糖的生物活性与结构特征有密切关系,而且多糖结构复杂多样,使多糖的结构研究备受关注[10]。

自由基是人体在氧化反应中产生的有害物质,能损伤人体的组织和细胞,并引起慢性疾病和衰老。抗氧化物可以清除自由基,使生物体保持健康状态。目前,市面上大部分抗氧化剂都是通过人工合成而来的,具有毒害作用,会引起肝损伤及致癌风险[11]。而天然的抗氧化剂毒性小、易获取,从天然植物中筛选清除体内自由基的天然抗氧化剂具有重要的实际意义。左丽敏等[12]通过超声波提取法提取海巴戟果实多糖,用不同体积分数的乙醇醇沉得到粗多糖,并测定其对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基清除率,发现70%乙醇醇沉海巴戟多糖的抗氧化活性最强。超声波提取过程中,超声波会破坏植物的细胞壁,可能会影响多糖的结构和功能。而热水浸提法成本低、操作简便,并且对多糖分子的破坏小,被广泛应用于植物多糖的提取。本研究以热水浸提法提取海巴戟果实粗多糖并进行纯化,用红外光谱、核磁共振以及气相色谱-质谱联用技术分析纯化多糖的结构特征,并测定海巴戟粗多糖和纯化多糖清除自由基的能力和还原能力,以期进一步开发海巴戟果实多糖在天然抗氧化剂领域的应用潜力。

1 材料与方法

1.1 原料、试剂与仪器

海巴戟(MorindacitrifoliaL.),成熟的果实采集于云南省元江市海巴戟标准化种植基地,将采收的果实用纯水冲洗之后、擦干表面水分、切片,置于60 ℃鼓风干燥箱中烘干,粉碎成果粉,过0.15 mm筛,装入自封袋中,放于60 ℃干燥器中保存备用。ABTS、DPPH,美国Sigma公司;抗环血酸(Vc)等其他试剂均为国产分析纯。

FT-IR 650傅里叶变换红外光谱(FT-IR)仪,天津港东科技发展股份有限公司;QP2010 plus气相色谱-质谱联用(GC-MS)仪,日本岛津公司;Bruker 600M核磁共振波谱(NMR)仪,德国Bruker公司;TU1901紫外分光光度计,北京普析有限公司。

1.2 海巴戟果实多糖的提取及纯化

称取500 g的海巴戟果实干粉,参照袁海华等[13]所得最优提取工艺提取海巴戟果实多糖,加入无水乙醇使最终体积分数为80%进行醇沉,Sevage法除蛋白,得到粗多糖。采用AB-8大孔树脂脱色,运用DEAE Sepharose Fast Flow凝胶柱分离纯化,用蒸馏水洗脱得到纯化多糖。

1.3 多糖结构分析

1.3.1FT-IR分析 称取多糖样品2 mg、溴化钾200 mg研磨,压制成透明的圆形薄片,通过FT-IR仪进行扫描,波数范围400～4 000 cm-1。

1.3.2GC-MS分析 分析之前先进行甲基化处理。将多糖样品放入反应瓶中,加入DMSO后快速加入NaOH粉末,封闭反应瓶,超声波溶解后,再加入碘甲烷进行甲基化反应,最后加入蒸馏水终止反应。取甲基化后的样品进行乙酰化,采用GC-MS仪测定乙酰化产物样品。GC分析的色谱柱的条件为RXI-5 SIL MS色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm),程序升温:起始温度130 ℃,3 ℃/min升温至250 ℃,保持10 min,进样口温度为250 ℃,检测器温度为250 ℃,载气为氦气,流速为3 mL/min。质谱扫描范围 40～500 u,间隔时间0.2 s,以高纯氦气为载气,溶剂延迟3 min。

1.3.31H NMR分析 取100 mg的多糖样品溶于0.5 mL的D2O中,TMS为内标。通过NMR波谱仪在25 ℃下进行样品测定,收集1H NMR的光谱信号。1H NMR是在小化学位移范围内分析多糖结构,主要是判断多糖中糖残基数、糖环构型以及异头构型等。

1.4 体外抗氧化活性试验

1.4.1对ABTS自由基(·ABTS+)清除能力 根据Re等[14]的方法稍作改动。·ABTS+工作液配制:将14 mmol/L ABTS、 4.90 mmol/L过硫酸钾等体积混合后避光、室温条件下反应16 h,反应完成后用甲醇适当稀释,使其在波长734 nm处吸光度值为0.700±0.002。取1.0 mL不同质量浓度的多糖样品溶液,加入2.0 mL·ABTS+工作液,混匀,室温下反应10 min,用紫外分光光度计于734 nm处测定吸光度值,以Vc为阳性对照。·ABTS+清除率(η·ABTS+)计算公式如下:

η·ABTS+=(1-(A1-A2)/A3)×100%

式中:A1—1.0 mL多糖溶液+2.0 mL·ABTS+工作液的吸光度值;A2—1.0 mL多糖溶液+2.0 mL蒸馏水的吸光度值;A3—1.0 mL蒸馏水+2.0 mL·ABTS+工作液溶液的吸光度值。

1.4.2对DPPH自由基(DPPH·)清除能力 根据文献[15]报道的方法稍作修改。取1.0 mL不同质量浓度的多糖样品溶液,分别加入2.0 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液,混匀,暗反应40 min。暗反应完成后,于波长517 nm处测定吸光度值,以Vc为阳性对照。DPPH·清除率计算公式同1.4.1节。

1.4.3对羟基自由基(·OH)清除能力 根据Acker等[16]报道的方法稍作修改。取1.0 mL不同质量浓度的多糖样品溶液,依次加入1.0 mL 9 mmol/L FeSO4溶液、 1.0 mL 9 mmol/L H2O2溶液、 1.0 mL 9 mmol/L水杨酸乙醇溶液,在37 ℃下水浴30 min后,取出试管并在波长510 nm处测定吸光度值,以Vc为阳性对照。·OH清除率计算公式同1.4.1节。

2 结果与分析

2.1 海巴戟果实多糖的提取与纯化结果

根据袁海华等[13]最佳提取工艺提取粗多糖,得到粗多糖47.38 g,提取得率为9.48%。通过大孔树脂脱色,得到脱色后的多糖20.36 g,经过蒸馏水洗脱得到均一的纯化多糖,质量为1.77 g,纯化多糖得率为0.35%。

2.2 纯化多糖的结构分析

图1 纯化多糖的红外光谱 图2 纯化多糖衍生物的总离子流色谱Fig.1 FT-IR spectrum of purified polysaccharides Fig.2 Total ion current chromatography of purified polysaccharides derivatives

糖醛酸是多糖抗氧化活性的有效指标,糖醛酸含量与植物抗氧化性呈正相关[22]。红外光谱分析发现纯化多糖中含有糖醛酸,表明获得的海巴戟纯化多糖具有抗氧化性。

2.2.2GC-MS分析 将纯化多糖经过甲基化、水解、还原及乙酰化后得到的产物,利用GC-MS分析,得出纯化多糖衍生物的总离子流色谱见图2。图中得到6个主要的离子流峰,对6个峰进行提取,对比标准数据库进行分析,得到纯化多糖糖基的连接方式及各种键型的比例见表1。

表1 海巴戟果实纯化多糖的GC-MS分析结果1)Table 1 GC-MS analysis results of purified polysaccharides from M. citrifolia fruit

由表1可知,纯化多糖的连接方式主要以→4)-吡喃葡萄糖-(1→和非还原末端的吡喃葡萄糖为主,另外还含有→3,6)-吡喃半乳糖-(1→、→3)-吡喃半乳糖-(1→、→2,6)-吡喃甘露糖-(1→以及少量的→6)-吡喃半乳糖-(1→,通过积分计算面积得出这6种连接方式的物质的量比约为0.248∶0.212∶0.181∶0.138∶0.135∶0.086。由于海巴戟果实纯化多糖结构中含有→2,6)-吡喃甘露糖-(1→和→3,6)-吡喃半乳糖-(1→,可以初步推测纯化多糖中可能含有分支结构。本研究得到的海巴戟纯化多糖为均一的多糖,其分子质量为5 213 u,主要由葡萄糖、半乳糖和甘露糖组成,以半乳糖和甘露糖为主。

2.2.31H NMR分析 由图3可以看出,δ3.2～4.2间的信号是非异头氢的CH2和CH的信号,重叠严重,一般是不能给出有效的结构信息。在δ5.0～5.5和δ4.5～5.0都存在化学位移,因此可以确定海巴戟多糖中既存在α-型糖苷残基,也存在β-型糖苷残基[23]。δ4.69处的峰为溶剂D2O峰,而属于异头氢的化学位移有δ4.86、 4.87、 4.95、 4.96、 5.18、 5.19、 5.26、 5.33、 5.36、 5.46和5.47。由此表明:海巴戟果实纯化多糖主要为β-型糖苷,同时还有少量α-型糖苷。常相娜等[24]通过NMR分析得出融水香菇多糖为β型的吡喃多糖;向瑞琪等[25]通过水提醇沉法提取香菇、黑木耳和红托竹荪的边角废料菌托中的多糖,采用NMR分析得出,这3种多糖为既具有α构型又具有β构型的酸性多糖。

a.全图total graph; b.局部放大图partial enlarged detail图3 海巴戟果实纯化多糖的1H NMR(25 ℃)Fig.3 1H NMR spectra(25 ℃) of purified polysaccharide from M. citrifolia fruit

2.3 粗多糖和纯化多糖的抗氧化活性

2.3.1·ABTS+清除能力 由图4(a)可知,海巴戟果实粗多糖和纯化多糖对·ABTS+都具有一定的清除能力。粗多糖质量浓度为1 g/L时,对·ABTS+的清除率达到100%,之后随着质量浓度增加而趋于稳定。纯化多糖质量浓度为0～5 g/L时,对·ABTS+清除率与纯化多糖质量浓度呈正相关,在质量浓度为5 g/L时,·ABTS+的清除率达到100%。由此可知:海巴戟果实多糖具有很强的·ABTS+清除能力,低浓度时,粗多糖较纯化多糖的清除能力强,且粗多糖对ABTS+的清除能力与Vc相当。

图4 海巴戟果实多糖清除自由基的能力Fig.4 The radical scavenging ability assay of polysaccharide from M. citrifolia fruit

2.3.2DPPH·清除能力 由图4(b)可知,海巴戟果实粗多糖和纯化多糖在质量浓度为0～3 g/L时对DPPH·清除率与多糖质量浓度呈正相关,3 g/L时清除率达到最大,分别为93.50%和30.18%;随着质量浓度继续增加,清除率略有下降。与纯化多糖相比,粗多糖具有更强的DPPH·清除能力,但略低于Vc。鲁铁等[26]研究也发现了相似的规律:多糖质量浓度在一定范围(0.5～2.0 g/L)内,对DPPH·的清除能力与质量浓度呈量效关系;而超过该质量浓度范围时,随着多糖质量浓度的增加,对DPPH·的清除能力呈现下降趋势;2.0 g/L时,白蜡多年卧孔菌子实体和菌丝体多糖对DPPH·的清除率达到最大,分别为45.67%和51.67%。纯化多糖对DPPH·清除率远低于粗多糖,主要原因可能是粗多糖中的糖醛酸和蛋白质含量较高,而糖醛酸含有丰富的羧基和羟基,能够给DPPH·提供质子,从而清除DPPH·[27]。

2.3.3·OH清除能力 由图4(c)可知,质量浓度为1～5 g/L时,·OH清除率与粗多糖的质量浓度呈现正相关,在5 g/L时清除率为86.71%。纯化多糖在1 g/L时·OH清除率最大为45.81%,在2 g/L时迅速下降至15.36%,2～5 g/L范围内·OH清除率基本保持不变。可以看出,海巴戟果实粗多糖的·OH清除能力强于纯化多糖。

2.3.5还原力 海巴戟果实粗多糖和纯化多糖的还原力测定结果见图5。由图可知,海巴戟果实粗多糖和纯化多糖均具有还原能力。在1～5 g/L范围内,粗多糖还原力与质量浓度呈现正相关,在5 g/L时还原力最大为1.01。在1～4 g/L范围内,纯化多糖还原力与质量浓度呈现正相关,在4 g/L时还原力达到最大为0.26,随后下降。可以看出,海巴戟果实粗多糖的还原力大于纯化多糖,但均低于阳性对照Vc。

图5 海巴戟果实多糖的还原力Fig.5 Reducing power of polysaccharides from M. citrifolia fruit

3 结 论

3.1以海巴戟果实为原料,干燥、粉碎后经热水浸提法提取得到粗多糖,提取得率为9.48%,进一步纯化得到纯化多糖的得率为0.35%。通过FT-IR、GC-MS和1H NMR分析表明:纯化多糖主要为β-型糖苷,同时还有少量α-型糖苷;纯化多糖是以1→4连接的吡喃葡萄糖和非还原末端的吡喃葡萄糖为主要连接方式的多糖,由于存在1→2,6连接的吡喃甘露糖和1→3,6连接的吡喃半乳糖,所以纯化多糖存在分支结构。

3.3海巴戟粗提多糖提取工艺简单,抗氧化能力强,具有开发为天然抗氧化剂的巨大潜力。