浒苔抑菌成分的提取工艺优化及其活性研究

张中堂, 陈天乐, 柏亚萱, 盘赛昆,2*

(1.江苏海洋大学 海洋食品与生物工程学院,江苏 连云港 222005; 2.江苏海洋大学 江苏省海洋生物技术重点实验室;江苏省海洋生物产业技术协同创新中心,江苏 连云港 222005)

浒苔俗称苔条、苔菜,是一种常见的多细胞绿藻,全球有40余种,我国有11种,分别为肠浒苔、条浒苔、管浒苔、扁浒苔和缘管浒苔等[1],主要分布在我国福建、江苏、浙江、辽宁、山东等地。浒苔繁殖能力极强,只要到达繁殖温度,就能快速增殖,而且抗逆性很强,即使在恶劣的环境下只要满足生长条件,就会迅速繁殖。由于浒苔能附生在其他养殖生物体上,因此常被当作一种有害生物,同时浒苔对环境也会造成很大危害[2-4]。浒苔因具有一定的食品、药理价值,所以对于其活性成分的提取是高效利用的关键环节。Rizvi等[5]对巴基斯坦海岸26种海藻进行了抗菌活性筛选, 发现肠浒苔对多种真菌具有抑制活性。Hellio等[6]研究了30种海藻提取物对35种海洋附生细菌的抑制作用,结果发现肠浒苔乙醇提取物对6种革兰氏阳性细菌具有较强的抑制活性(抑菌圈直径5～6 mm),对另5种革兰氏阳性细菌有一定的抑制活性(抑菌圈直径3～4 mm)。Mehrtens[7]对北极21种大型海藻的研究发现:扁浒苔具有较高的碘代过氧化物酶活性,而该活性可能与其抗菌等化学防御作用相关。海藻中抗菌活性物质主要有脂类、酚类、萜类、多糖类、卤化物、含硫化合物等。目前在浒苔中已经鉴定出许多活性组分。如李凌绪等[8]发现浒苔的乙醇提取物对甜椒灰霉菌、链格孢菌有较强的抑制作用,对立枯丝核菌、苹果干腐菌、香蕉炭疽菌、镰刀菌等植物病原真菌菌丝生长也有一定抑制作用,推测活性成分可能为酚类、糖类、内酯或甾醇。Shahnaz等[9]研究发现肠浒苔甲醇提取物对3种细菌和10种真菌均具有抗菌活性,并利用质谱、核磁和GC-MS技术从活性提取物中分离鉴定出β-谷甾醇、反式-植醇和多种脂肪酸物质。Sukatar等[10]发现缘管浒苔甲醇和氯仿提取物对5种革兰氏阳性细菌、 4种革兰氏阴性细菌和白色念珠菌的抗菌活性明显强于正己烷和二氯甲烷提取物,并运用GC-MS鉴定了缘管浒苔中的35种挥发性成分,主要有正三十四烷(8.45%)、正十七胺(6.65%)、二十二烷(6.46%)。对浒苔中各种生物活性物质的开发研究,可为新型保健品、化妆品、食品、药品等开发提供新的思路,从而为浒苔资源的进一步加工利用提供理论依据。因此,本研究对浒苔抑菌活性成分的提取工艺进行了优化,考察了条浒苔水提取物和乙醇提取物对金黄色葡萄球菌等的抑制作用,并通过GC-MS对抑菌物质进行成分分析。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

条浒苔悬液,自制[11];菌种:大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis),所有菌株均为实验室培养。

石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、正丁醇、甲醇、三氯化铁、无水乙醇、三氯化铝、乙酸镁、氯化钠、硅钨酸,均为市售分析纯;硅胶板,青岛海洋化工有限公司;硅胶板营养肉汤,北京陆桥股份技术有限公司;琼脂,上海阿拉丁公司;酵母提取物、胰蛋白胨,英国OXOID公司。

DNP-9162电热恒温培养箱,上海精宏实验设备有限公司;ZF-20D暗箱紫外分析仪,巩义市予华仪器有限责任公司;GC-2010气相色谱-质谱联用(GC-MS)仪、DB-23色谱柱,岛津(上海)实验器材有限公司。

1.2 提取方法

1.2.1水提取 将300 mL条浒苔悬液倒入平底蒸馏瓶,80 ℃水浴回流4 h,回流提取3次,合并提取液,离心、过滤,旋转蒸发浓缩至黑色浸膏状,4 ℃冰箱内保存备用。

1.2.2乙醇提取 按照文献[8]方法:将10 g条浒苔粉加入平底蒸馏瓶,倒入体积分数为95%乙醇溶液300 mL,80 ℃水浴回流4 h,回流提取3次,收集并合并提取液,离心、过滤。用旋转蒸发仪减压回收乙醇至无醇味,得黑色浸膏状,4 ℃冰箱内保存备用。

1.3 抑菌活性测试

1.3.1待测溶液配制 采用牛津杯法[12-13]进行抑菌试验,所用器皿与材料灭菌备用。分别称取2种提取方法的条浒苔浸膏1 g溶解在10 mL单蒸水中,调配成质量浓度为100 g/L的待测溶液。

1.3.2供试菌株的培养及活化 -80 ℃冰箱取出保存的菌株,无菌条件下用枪头吸取50 μL于平板牛肉膏蛋白胨培养基中,三区划线法将供试菌株均匀分布,放入培养箱中37 ℃培养24 h。相同方法连续培养两代。

1.3.3菌悬液的制备 将灭菌后的生理盐水,培养箱里取出的含菌平板放入超净工作台内,从中划取一环菌株,再用生理盐水在试管中配制成107cfu/mL的菌悬液。

1.3.4条浒苔不同提取物的抑菌圈检测 无菌条件下将平板,琼脂培养基放入超净工作台内,制作成培养基板,将指示菌的菌悬液打入培养皿板中,涂布,再将牛津杯放入已经凝固的含菌平板上,轻轻按压,吸取100 μL待测溶液打入每个牛津杯中,每块平板里各放3个牛津杯,然后所有待检测菌株实验设计3次,以95%乙醇溶液为阴性对照,然后放入生化培养箱中培养,设置培养温度为37 ℃,培养16 h后取出,用游标卡尺测量抑菌圈大小,计算平均值。

1.4 浒苔抑菌物质的提取工艺优化

1.4.1单因素试验 准确称取10 g的烘干条浒苔粉,按照一定液料比(20∶1～50∶1,mL∶g,下同)加入一定体积分数(65%～95%)的乙醇溶液,在一定温度(60～90 ℃)下恒温水浴提取一定时间(2～5 h)。提取液5 000 r/min离心,并在旋转蒸发仪中浓缩至无醇味黑色浸膏状。考察液料比、乙醇体积分数、提取温度和提取时间对抑菌圈直径的影响。

1.4.2响应面试验优化 根据单因素试验结果,发现提取时间对条浒苔提取物抑菌效果的影响并不显著,因此固定提取时间为4 h。响应面试验依照Box-Beheken中心原理设计实验组合[14-15],以抑菌圈直径为响应值,选择提取温度、液料比、乙醇体积分数设计3因素3水平响应面分析试验。

1.5 浒苔中主要成分常规定性分析

1.5.1待测溶液配制 称取0.25 g响应面优化法得到的条浒苔提取物,用95%乙醇溶液溶解至50 mL,备用。

1.5.2生物碱成分检测 准确称量0.5 g硅钨酸,溶解在10 mL灭过菌的单蒸水中,调配为硅钨酸试剂。在试管里添加2 mL样品溶液,加入2～3滴硅钨酸溶液,观察是否有浅黄色或灰白色沉淀。

1.5.3蒽醌及其苷类检测 取样品溶液5 mL于试管内,滴加少量1%乙酸镁甲醇溶液,观察其颜色是否呈现红色反应。

1.5.4酚类成分的检测 取样品溶液5 mL于试管内,加入2 mL 1%的三氯化铁乙醇溶液,观察其颜色是否呈绿色、暗紫色或生成沉淀。

1.5.5黄酮及其苷类检测 取5 mL样品溶液于试管内,加入2 mL 1%三氯化铝乙醇溶液,观察其颜色是否变为亮黄色。

1.5.6有机酸检测 取样品溶液滴在pH试纸上,观察试纸颜色是否低于pH值7。

1.5.7甾醇、萜类检测 取样品溶液5 mL于试管内,加入5 mL氯仿,再沿试管壁小心缓慢加入浓硫酸,观察氯仿层是否呈红色反应。

1.5.8皂苷成分检测 取适量样品溶液于试管中,盖上橡胶塞子,握住试管用力振摇1 min,如有大量蜂窝状气泡产生,静置一段时间后,气泡没有消失,说明含有皂苷成分。

1.6 不同溶剂萃取物的制备及抑菌实验

1.6.1萃取物的制备 将最佳工艺条件下得到的10 g条浒苔提取物溶解于100 mL去离子水中,移入1 000 mL分液漏斗内,加入300 mL石油醚,摇晃混匀并分层后,排出石油醚萃取液。用上述萃取方法将留下的水溶液重复萃取2次,3次石油醚萃取液合并后,用旋转蒸发仪减压回收石油醚,得到石油醚萃取物。萃取后留下的水溶液依次用二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取3次,并减压浓缩后,得到二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水溶物。

1.6.2抑菌实验 各萃取物旋干溶剂后用乙醇配制成10 g/L的样品溶液,以金黄色葡萄球菌为供试菌,用牛津杯法进行抑菌实验。

1.7 乙酸乙酯萃取物的GC-MS分析

DB-23毛细管柱,初始温度50 ℃,保持4 min,以4 ℃/min升至230 ℃,保持5 min;载气为氦气,载气流量为10 mL/min,进样口温度250 ℃;进样量1 μL;分流比50∶1。轰击电压70 eV,质谱扫描范围40～550 u;离子源温度200 ℃;GC-MS接口温度250 ℃;标准质谱图检索库NIST。

2 结果与讨论

2.1 不同溶剂提取物的抑菌效果比较

不同溶剂提取物的抑菌效果见表1。由表可知,条浒苔的水提取物和乙醇提取物对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌无抑制作用;水提取物对金黄色葡萄球菌也无抑制作用,而乙醇提取物对金黄色葡萄球菌具有抑制效果,抑菌圈直径达到1.06 cm。因此,后续优化工艺过程中考察对金黄色葡萄球菌的抑菌效果。

表1 不同条浒苔提取物的抑菌效果Table 1 The antibacterial effect of different extracts from E. clathrata

2.2 单因素试验结果分析

2.2.1液料比 在提取时间4 h、提取温度80 ℃和乙醇体积分数95%条件下,液料比对条浒苔提取物抑菌效果的影响结果见图1(a)。由图可知,抑菌圈的大小会因为液料比的不同而出现波动,液料比由20∶1增加到30∶1时,抑菌圈直径逐渐增大,并在30∶1时抑菌圈直径最大,之后随着液料比的继续增大,抑菌圈直径逐渐减小。因此,液料比30∶1时抑菌效果最佳。

a.液料比值liquid-solid ratio; b.提取时间extraction time; c.提取温度extraction temp.; d.乙醇体积分数ethanol volume fraction图1 不同条件对条浒苔提取物抑菌效果的影响Fig.1 Effect of different conditions on antibacterial effect of enteromorpha extract

2.2.2提取时间 在液料比30∶1、提取温度80 ℃和乙醇体积分数95%条件下,提取时间对条浒苔提取物抑菌效果的影响结果见图1(b)。由图可知,抑菌圈的大小也会因为提取时间的不同而出现变化,2～4 h时抑菌圈大小会呈现出缓慢增大的趋势,这是因为浒苔含有的抑菌活性成分因提取时间的延长而被溶出,且抑菌圈直径在提取时间为4 h时达到最大。4 h以后,提取时间继续延长,抑菌圈直径略有减小,这是因为提取时间一直延长,提取出来的抑菌活性成分结构极有可能被破坏。因此,提取时间选择4 h为宜。

2.2.3提取温度 在液料比30∶1、提取时间4 h和乙醇体积分数95%条件下,提取温度对条浒苔提取物抑菌效果的影响结果见图1(c)。由图可知,抑菌圈的大小还会因为提取温度的不同而出现变化,在60 ℃时,可能因为温度不够高,达不到提取大量有效抑菌物质的要求,所以抑菌作用较弱;而在70 ℃时抑菌作用略有提升,可能是温度的提高使一些具有抑菌作用的成分被溶出;随着温度继续升高,到达80 ℃时,可能由于到达了抑菌活性成分溶出点,对金黄色葡萄球菌抑菌作用最强。当温度继续升高时,抑菌效果反而减小,这可能是由于温度太高,使具有抑菌作用的活性成分遭到破坏。因此,选择80 ℃作为条浒苔最佳提取温度。

2.2.4乙醇体积分数 在液料比30∶1、提取温度80 ℃和提取时间4 h条件下,乙醇体积分数对条浒苔提取物抑菌效果的影响结果见图1(d)。由图可知,当乙醇体积分数为65%和75%时没有抑菌圈出现,不具有抑菌作用,这可能是因为乙醇体积分数尚未达到提取其抑菌物质的效果。当乙醇体积分数为85%时出现抑菌作用,可能是随着乙醇体积分数的升高,达到了破坏条浒苔结构的效果,使具有抑菌作用的物质被提取出来。继续增大乙醇体积分数到95%时,抑菌效果更好,可能是越来越多的抑菌活性成分因为乙醇体积分数的升高而被溶解出来。因此,选择体积分数为95%乙醇作为提取溶剂。

综上所述,选择液料比30∶1、提取时间4 h、提取温度80 ℃和乙醇体积分数95%时提取效果较佳。

2.3 响应面试验结果分析

2.3.1响应面试验设计及结果 选择液料比(X1)、提取温度(X2)、乙醇体积分数(X3)为自变量,抑菌圈直径(Y)为响应值,根据Box-Beheken模型,通过选用响应面8.0.6软件设计,得到响应面试验设计及结果见表2。

表2 Box-Beheken试验设计与结果Table 2 Design and results of Box-Beheken experiment

2.3.2方差分析 对回归模型进行方差分析,结果见表3。

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of the regression model

2.3.3最优提取工艺的确定和验证实验 通过响应面软件分析,获得最优工艺参数为:液料比28.25∶1、提取温度83.52 ℃、乙醇体积分数91.53%,此条件下浒苔提取物对金黄色葡萄球菌最大抑菌圈直径预测值为1.164 cm。为操作方便选择液料比为30∶1、提取温度为83 ℃、乙醇体积分数为92%。在最优提取工艺条件下做3次验证实验,得到金黄色葡萄球菌抑菌圈直径为(1.152±0.015)cm,与模型预测值基本一致。因此,此实验设计的优化模型参数,能为浒苔抗菌活性成分的提取进行较好的优化。

2.4 浒苔抗菌物质常规定性分析

对生物碱成分、蒽醌及其苷类、酚类成分、黄酮及其苷类、有机酸、甾醇及萜类、皂苷成分进行检测,结果发现:生物碱、蒽醌及其苷类、酚类、黄酮及其苷类检测均未产生沉淀或相应的颜色反应,表明条浒苔乙醇提取物中不存在上述成分;有机酸检测发现pH试纸呈现橙黄色,表明提取物中含有有机酸物质;甾醇及萜类检测发现氯仿层有红色反应,表明提取物中含甾醇及萜类物质;皂苷检测发现用力振摇后无气泡产生,表明提取物中无皂苷成分。

2.5 不同溶剂萃取物的抑菌效果

从表4可以看出,石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯萃取物都具有抑菌活性成分,对金黄色葡萄球菌都有良好的抑制作用,其中乙酸乙酯萃取物的抑菌效果最好,其次是二氯甲烷萃取物,最后是石油醚萃取物,而正丁醇萃取物和水萃取物对金黄色葡萄球菌基本没有抑制作用。说明浒苔中的大多数抑菌活性成分都集中在乙酸乙酯萃取物中,主要以中等和弱极性的物质为主。

表4 不同溶剂萃取物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果Table 4 Antibacterial effect of different solvent extracts on S. aureus

2.6 乙酸乙酯萃取物的GC-MS分析

图2 乙酸乙酯萃取物的GC-MS总离子流Fig.2 Ethyl acetate extract GC-MS total ion chromatogram

3 结 论

3.1通过对条浒苔水提取物和乙醇提取物的抑菌活性研究发现:与水提取物相比,条浒苔乙醇提取物的抑菌效果更好,对金黄色葡萄球菌有较好的抑制效果,而对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌没有抑菌作用。

3.2通过单因素试验和响应面分析法优化乙醇提取浒苔抑菌活性物质的提取工艺,得到最佳提取工艺条件为:乙醇体积分数92%、液料比30∶1、提取温度83 ℃、提取时间4 h。此条件下,乙醇提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为(1.152±0.015) cm。

3.3采用定性化学分析方法对条浒苔乙醇提取物中的抑菌成分进行检测,结果表明:条浒苔乙醇提取物中含有有机酸类、甾醇及萜类等成分,不含生物碱、蒽醌、酚类、皂苷、黄酮类等成分。不同溶剂萃取物对金黄色葡萄球菌的抑菌实验结果表明:乙酸乙酯萃取物的抑菌效果最好,二氯甲烷和石油醚萃取物次之,正丁醇和水萃取物没有抑菌效果。通过GC-MS对乙酸乙酯萃取物进行分析,发现乙酸乙酯萃取物中含有12种挥发性成分,主要为酸类、芳香类化合物。