不同保存条件下血浆补体含量观察

韩智 韩钰洁 张海红

(1 武威市中心血站,甘肃 武威 733000,2 中央民族大学理学院,3 甘肃省红十字血液中心)

补体是血液或体液中正常存在的、参与免疫效应的、并可具有酶活性的一组球蛋白分子[1]。在正常生理状态下,绝大多数补体固有成分均以非活化形式存在,受某种激活剂作用后即出现一系列级联反应,各种补体固有成分依次活化,最终产生溶细胞性效应。同时,补体也可介导病理损伤,如引起过敏反应、输入红细胞的血管内溶血、溶解红细胞或白细胞及血小板、活化血小板等[1]。因此,补体分子在输血医学领域具有十分重要的作用[1]。

至今已知补体系统由20 余种成分组成。在血清中的含量以C3 为最高,其次为C4、S 蛋白和H 因子[2]。为了观察成分血输入人体前补体含量变化,我们从采血后6h 内分离血浆开始分别留取－60℃、－40℃、4℃、22℃几种不同保存温度和制备工艺阶段的血浆样本,检测本地区几种常见血液制品在不同保存阶段补体C3、C4 含量,以期反映成分血在临床输注前补体等蛋白成分含量变化情况,为循证输血医学积累数据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 随机选取本站2022 年8—10 月期间来自于无偿献血者血液分离的血浆,其中20 人份普通血浆、20 人份新鲜冰冻血浆,分别留取新鲜冰冻血浆不同制备工艺阶段标本,共180 份,无偿献血者均符合«献血者健康检查要求»[3],检测几种常见成分血制品在不同制备工艺阶段、不同保存温度等条件下补体C3、C4 含量,下文所述新灭浆为新鲜冰冻血浆经制备后的病毒灭活血浆,普灭浆为普通冰冻血浆经制备后的病毒灭活血浆。

1.2 实验方法 补体C3、C4 均采用免疫比浊法检测。

1.2.1 设备 日立008AS 全自动生化分析仪。

1.2.2 试剂 补体C3、C4 均采用批号220817102 美康生物试剂盒,质控品采用郎道HN1530,质控品批号为1376UN。

1.3 实验分组 按照制备工艺、保存温度和时间段不同,将本站来自于无偿献血者血浆在不同制备工艺阶段留取各自的同源标本共180 份,集中在同一批次实验检测,排除了不同批次检测带来的实验干扰,观察不同保存温度和不同工艺阶段分组条件下补体C3、C4 含量变化,实验结果分为九组,下文括号内数字(一)～(九)为检测结果分组号,与表1 所示分组号相同。

1.3.1 血液采集后6 h 内离心分离细胞和血浆 留取第1 批标本,随袋装血浆速冻后分别保存于－40℃和－60℃,分别代表－40℃原始血浆(一)和－60℃原始血浆(二)。

1.3.2 普通血浆加亚甲蓝6℃光照进行病毒灭活 速冻前留取第二批标本,随血浆分别保存于－40℃和－60℃,在检测前置4℃保存7 d,模拟全血在4℃保存7 d 状态,保存于－40℃普通灭浆(三)和－60℃普通灭浆(四)。

1.3.3 新鲜冰冻血浆经分离冷沉淀后,加亚甲蓝于6℃光照病毒灭活 速冻前留取第3 批标本,随血浆分别保存于－40℃和－60℃,代表新鲜冰冻血浆经分离冷沉淀、病毒灭活工艺后－40℃新灭浆(五)和－60℃新灭浆,其中－60℃新灭浆在检测前7 d 置于4℃,代表经两种工艺后4℃保存7 d 的新灭浆(六)。

1.3.4 新鲜冰冻血浆在保存30 d 后,于6℃水浴融化离心分离冷沉淀 在断离前将血浆联袋间管路热合留取第四批标本,分别保存于－40℃和－60℃,分别代表离心法分离制备的－40℃冷沉淀(七)和－60℃冷沉淀(八)。

1.3.5 将新鲜冰冻血浆经分离冷沉淀 工艺后－60℃冷沉淀(八)标本一分为二,分出的一份于检测前置于22℃震荡保存48h,模拟48h 浓缩血小板(九)。

1.4 统计学方法 采用SPSS 26.0 统计学软件处理数据,计量资料以(±s)表示,采用秩和检验[4]中的Wilcoxon 符号秩检验,以P<0.05 为差异有统计学意义,组间相关性比较采用Spearman 相关性分析,以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 补体C3、C4 含量检测结果比较 用同一标本检测C3、C4 含量,将检测结果按照分组条件整理为九组进行比较,见表1。

冷沉淀(组)一二三四五六七八九C30.76±0.120.82±0.150.72±0.130.77±0.130.73±0.160.76±0.160.93±0.160.80±0.111.04±0.17 P①0.994 1②0.133 3③0.240 6④0.047 0⑤0.038 3⑥0.999 9⑦0.418 6⑧0.997 9⑨1.000 0 C40.24±0.050.25±0.050.22±0.040.23±0.040.22±0.050.22±0.040.27±0.040.25±0.040.31±0.06 P①0.957 1②0.027 3③0.025 1④0.042 6⑤0.012 1⑥0.998 7⑦0.564 0⑧0.996 8⑨0.999 7

2.1.1 不同阶段血浆补体C3 含量比较 观察不同保存温度和时间段分组条件下补体含量检测结果(表1)。表中可见:④保存在－40℃的原始新鲜冰冻血浆在制备为新灭浆后的补体C3 的含量有显著变化,制备前后保存时间、保存温度没有变化,证明制备冷沉淀的制备工艺中存在能显著改变补体C3 含量的影响因素,存在统计学差异,⑤保存在－60℃的原始新鲜冰冻血浆和4℃保存新灭浆补体C3 的含量有统计学差异,保存时间没有变化,制备后的保存温度有变化,证明制备冷沉淀后的新灭浆的制备工艺,和制备后的保存温度二者中存在能显著改变补体C3 含量的影响因素。

2.1.2 不同阶段血浆补体C4 含量比较 观察不同保存温度和时间段分组条件下补体含量检测结果,与上述补体C3 含量比较结论基本一致(表1)。表中可见:②－40℃原始新浆与模拟全血4℃保存7 d 的普灭浆补体C4 含量存在统计学差异,保存时间和制备前保存温度没有改变,证明制备灭浆的制备工艺和制备后的保存温度二者中存在能显著改变补体C4 含量的影响因素,③保存在－60℃的原始新浆与模拟全血4℃保存7 d 的普灭浆补体C4 含量存在统计学差异,保存时间和制备前保存温度没有改变,证明制备普灭浆的制备工艺和制备后的保存温度二者中存在能显著改变补体C4 含量的影响因素,④保存在－40℃的原始新浆和－40℃新灭浆补体C4 含量存在统计学差异,保存时间和温度没有变化,证明制备病毒灭活血浆的工艺能显著改变补体C4 含量,⑤保存在－60℃的原始新浆和4℃新灭浆补体C4 含量存在统计学差异,保存时间没有变化,制备后的保存温度有变化,证明新灭浆的制备工艺和制备后的保存温度二者中存在能显著改变补体C4 含量的影响因素。

2.2 补体C3、C4 之间的相关性分析 根据Spearman 相关性分析结果显示,补体C3 与补体C4 之间呈显著正相关(P<0.05),即在保存温度、时间段和制备工艺等变量条件一致情况下补体C3 与C4 的含量变化一致,见表2。

补体C3补体C4补体C31.000 0.894∗∗补体C40.894∗∗1.000

3 讨论

现行输血行业标准对补体含量没有明确要求[5]。各补体成分中C3 血清含量最高,在功能上是补体系统的核心分子。补体占血清球蛋白总量的10%,含量相对稳定,与抗原制激无关,故不能随着机体特异性免疫的建立和增强而增高,检测人血浆补体水平,可作为某些疾病后的辅助诊断证据了解病情[6-12]。由于临床治疗经常需要输注血液成分制品,而随之输入人体的补体成分在宿主体内的含量和作用的研究不多见。

补体活性不甚稳定,加热56℃,30min 即可灭活[2]。血液离开人体后,在不同温度下,随着保存时间的变化,其中的补体含量也不同。为真实反映不同保存和制备工艺条件下补体成分的变化,保证检测数据的可比性,检测标本采用同源血浆,从制备、保存各阶段留取的标本都与该血液成分制品处于相同保存条件。

限于条件,未做血浆补体活性[13]和稳定性[14]研究,本次实验仅检测血浆制品在不同保存温度和制备工艺阶段的补体C3、C4 含量,通过对比发现,原始血浆保存在－40℃与－60℃条件下补体C3、C4 的含量差异均没有显著性,保存在－40℃与－60℃的原始血浆与普通灭活浆的补体C3 含量变化不显著,C4 含量变化显著,不一致的原因分析或为样本量不足,或存在4℃保存温度和病毒灭活工艺对补体C4 影响≫补体C3 的可能,变化趋势说明4℃保存温度和病毒灭活工艺能够降低补体含量,保存在－40℃的原始血浆与－40℃新灭浆补体C3、C4 的含量均有显著差异,说明血浆冻融、光照灭活等制备工艺能显著改变补体C3、C4 含量,保存在－60℃的原始新浆与制备后4℃保存7 d[15]新灭浆的补体C3、C4 的含量均有显著差异,证明4℃保存7 d 的保存温度和保存时间、血浆冻融、光照灭活等制备冷沉淀的工艺能显著改变补体C3、C4 含量,保存在－40℃、－60℃的原始新浆与－40℃、－60℃冷沉淀补体C3、C4 的含量变化均无统计学意义,分析为低温离心导致血浆内补体等蛋白浓缩,保存在－60℃的浓缩冷沉淀与22℃保存48 h 模拟浓缩血小板补体C3、C4 含量降低不显著,且有升高趋势,分析为22℃震荡保存过程使原本低温离心沉淀浓缩的血浆补体又均匀溶解于血浆中。

综上所述,单纯－40℃、－60℃不同温度保存补体含量变化不显著,4℃保存7 d 是否能够显著降低补体含量,有待增加－60℃新灭浆和4℃保存7d 的新灭浆对照进一步排除制备病毒灭活血浆工艺的影响,22℃室温保存在48 h 内变化没有显著性。据报道,保存补体以低温为好[16],上述结论与报道结论相符。冰冻血浆反复冻融、离心浓缩、光照灭活等因素能够影响补体含量。补体C3、C4 含量测定实验相关性分析表明,二者在温度、制备工艺和保存时间等相同条件下的变化呈显著正相关。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。