基于网络药理学及动物实验探究雷公藤-白芍治疗类风湿关节炎的作用机制

李方泽，万磊，赵磊，朱子衡，马熙檬，李舒，胡赛赛，程静，陈莹莹

1.安徽中医药大学第一临床医学院，安徽合肥 230031；2.安徽中医药大学第一附属医院风湿免疫科，安徽合肥 230031

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种可导致全身多系统损害的自身免疫性疾病[1-2]。目前治疗RA的方法较为多样，其中以托法替布为代表靶向合成改善病情抗风湿药（targeted synthesis of disease-modifying anti-rheumatic drugs，tsDMARDs）为当今新一类治疗RA的药物，临床疗效显著[3-4]。通过药物精准调控RA某些通路或关键靶点，进而影响免疫炎症反应，缓解症状，是治疗RA新的有效方法。网络药理学可从分子网络角度分析药物、疾病与相关靶点及通路之间的联系，为新的靶向药物研发提供理论基础和依据[5]。

雷公藤（TripterygiumwilfordiiHook.f.）和白芍（PaeonialactifloraPall）被广泛应用于治疗RA[6]。雷公藤治疗RA具有独特的临床疗效，但其较大的毒副作用限制其临床应用[7]。白芍治疗RA效果较雷公藤弱，经常与有毒中药配伍，发挥减毒功效[8-9]。雷公藤与白芍配伍既可增加疗效，又可有效减少雷公藤对肝细胞的损伤[10-12]。本研究通过网络药理学分析雷公藤配伍白芍治疗RA可能的分子作用机制，并验证分析结果，为临床应用提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级雄性Wistar大鼠40只（购于安徽省实验动物中心，许可证号SYXK 2005-02），平均体质量（216.0±28.3）g，实验前适应性饲养7d。本研究经安徽中医药大学实验动物伦理委员会审批通过（伦理审批号：AHUCM-rats-2021022）。

1.1.2 药品与试剂 雷公藤、白芍购自安徽中医药大学第一附属医院中药房（生产单位：亳州市金方千草药业有限公司，货号：5656851、564822411，规格：500g/袋），雷公藤甲素购自Merck公司（货号：T3652-1MG，纯度≥98%）；肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）-4、IL-6、IL-17、酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒购自武汉基因美生物科技有限公司（货号：JYM0635Ra、JYM0647Ra、JYM0646Ra、JYM0480Ra）；弗氏完全佐剂（Freund’s complete adjuvant，FCA）购自美国Sigma公司（货号：MB9887）；Western一抗二抗去除液购自Beyotime公司（货号：P0025）；β-肌动蛋白购自Zsbio公司（货号：TA-09）；磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphorylated phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，p-PI3K）购自Abcam公司（货号：ab86714），磷酸化蛋白激酶B蛋白（phosphorylated AKT protein，p-AKT）购自CST公司（货号：4691S）。

1.1.3 仪器与数据库 多功能酶标仪（Molecular Decices公司，型号：spectra Max MZe）、转膜仪（上海天能科技有限公司，型号：VE-186）、自动曝光仪（上海培清科技有限公司，型号：JS-1070P）。使用中药系统药理学分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）及DisGeNET、GeneCards、String、Metascape、PubChem、PDBe在线数据库。

1.2 方法

1.2.1 网络药理学 ①雷公藤-白芍有效成分及作用靶点检索：利用TCMSP，设置关键词为“雷公藤”“白芍”，筛选条件为“口服生物利用度≥30%，类药性指数≥0.18”，检索雷公藤-白芍活性成分并预测作用靶点。②RA靶点检索：以“rheumatoid arthritis”为关键词，在DisGeNET和GeneCards收集RA靶点。③“雷公藤-白芍-活性成分-RA”网络构建：通过R获得共同作用靶点，利用Cytoscape 3.9.1构建“雷公藤-白芍-活性成分-RA”网络，并通过计算度中心性（degree），获取核心活性成分。④构建共同靶点蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络及核心靶点筛选：利用String数据库构建共同靶点PPI网络，设置物种为“H.sapiens”，最低要求互动分数为0.4，隐藏单独节点。使用Cytoscape 3.9.1 CytoNCA插件，计算网络中各靶点中介中心性（betweenness，BC）、接近中心性（closeness，CC）、degree、特征向量中心性（eigenvector，EC），以大于各靶点BC、CC、EC、degree中位数为条件，连续筛选两次，获得核心靶点。⑤富集分析：利用Metascape数据库对共同靶点进行富集分析，设置物种为“H.sapiens”，P<0.01。⑥分子对接：利用PubChem及PDBe数据库，分别下载核心有效成分与核心靶点的分子结构，采用AutoDock Tools及Pymol软件对其进行分子对接。

1.2.2 动物实验验证 ①药物制备：雷公藤及白芍各10g加入10倍水量浸泡2h，煎煮2次，第一次30min，第二次40min，将两次煎煮液混合均匀，室温静置30min，过滤并浓缩至生药浓度为1g/ml，置于4℃冰箱保存备用。②造模及分组干预：将大鼠随机分为正常对照（normal control，NC）组10只，关节炎模型组30只；NC组大鼠不做处理；关节炎模型组大鼠使用0.1ml FCA于右后足跖皮内进行注射，复制为佐剂关节炎（adjuvant arthritis，AA）大鼠模型，并于第12天在AA大鼠尾部注射0.05ml FCA加强免疫[13]。第15天将30只AA大鼠按随机数字表法分为模型（model control，MC）组、雷公藤-白芍（tripterygium wilfordii-white peony，TP）组及雷公藤甲素（triptolide，TPL）组，每组10只。第16天开始给药，每天1次，连续30d。TP组大鼠给予雷公藤-白芍汤剂浓缩液2.08g/kg灌胃，TPL组大鼠给予雷公藤甲素混悬液0.2mg/kg灌胃，NC组及MC组大鼠给予同体积生理盐水灌胃。③ELISA检测细胞因子：采集用药后第31天大鼠腹主动脉血，离心取上层血清，根据说明书利用ELISA试剂盒测定TNF-α、IL-6、IL-17及IL-4含量。④蛋白质印迹法（Western blot，WB）检测p-PI3K、p-AKT：用蛋白提取试剂盒提取用药后第31天大鼠滑膜总蛋白，进行电泳分离，采用半干法使蛋白质从胶转移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）。在室温下将p-PI3K、p-AKT抗体（1∶1000稀释）和PVDF膜孵育2h。采用一抗、二抗孵育，利用增强化学发光法显色并拍照，计算灰度值，以p-PI3K、p-AKT与β-肌动蛋白的比值为蛋白相对表达量。

1.3 统计学方法

利用SPSS 23.0统计学软件对数据进行处理分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，不符合正态分布的计量资料采用Wilcoxon秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 网络药理学及分子对接

2.1.1 雷公藤-白芍有效成分及作用靶点 获得有效成分雷公藤51个，白芍13个，共同有效成分61个。预测作用靶点雷公藤94个、白芍154个，共同作用靶点160个。

2.1.2 RA靶点检索 利用DisGeNET与GeneCards数据库分别收集RA靶点2723个和4465个，去除重复项后获得靶点5469个。

2.1.3 构建“雷公藤-白芍-活性成分-RA”网络及分析将160个共同作用靶点与5469个RA靶点利用R取交集，获得113个共同靶点，通过Cytoscape 3.9.1构建包括148个节点、353条边的“雷公藤-白芍-活性成分-RA”网络。利用degree值筛选排名前5位的核心活性成分，分别为山柰酚、雷公藤甲素、川陈皮素、β-谷甾醇和豆甾醇，可能为雷公藤-白芍治疗RA的核心活性成分，见图1、表1。

表1 雷公藤-白芍治疗RA核心有效成分

图1 中药-有效成分-作用靶点网络

2.1.4 PPI网络及核心靶点 String数据库获得拥有148个节点，353条相互作用连线的PPI网络，Cytoscape 3.9.1、CytoNCA插件获得12个核心靶点，分别为TNF、IL-6、IL-4、IL-2、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，AKT1）、前列腺素内过氧化物合成酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）、过氧化物酶体增生激活受体（peroxisome proliferative activated receptor，PPARG）、CXC趋化因子配体8（C-X-C motif chemokine ligand 8，CXCL8）、血管内皮细胞生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、细胞肿瘤蛋白P53（cellular tumor antigen p53，TP53）、信号转导和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP9），以上可能是雷公藤-白芍治疗RA的核心靶点，见图2。

图2 PPI网络及核心靶点

2.1.5 富集分析 获得1678条基因本体（gene ontology，GO）富集结果，其中GO生物过程（biological process，BP）1461条，包括炎症应答、细胞激活等；GO分子功能（molecular function，MF）151条，包括脂肽结合、蛋白酶结合等；GO细胞组分（cellular component，CC）66条，包括核膜、微绒毛等；富集分析获得信号通路191条，包括PI3K/AKT信号通路，TNF信号通路（TNF signaling-pathway）等，可能为雷公藤-白芍治疗RA的关键信号通路，见图3。

图3 GO和KEGG富集分析

2.1.6 分子对接 除川陈皮素及IL-2外，其余关键有效成分与核心靶点均可稳定结合，最低结合能均<-5kcal/mol，关键有效成分与核心靶点之间可形成多条化学键，空间结构稳定，见表2、图4。

表2 分子对接结合能（kcal/mol）

图4 分子对接模式图

2.2 动物实验验证

2.2.1 雷公藤-白芍对AA大鼠血清细胞因子的影响 与NC组大鼠相比，MC组大鼠的TNF-α、IL-6、IL-17显著升高，IL-4显著降低（P<0.05）；与MC组大鼠相比，TP组与TPL组大鼠的TNF-α、IL-6、IL-17均显著降低，IL-4显著升高（P<0.05）；与TPL组大鼠相比，TP组大鼠的TNF-α、IL-6、IL-17显著降低，IL-4显著升高（P<0.05），见表3。

表3 各组大鼠的细胞因子比较（±s，pg/ml，n=10）

表3 各组大鼠的细胞因子比较（±s，pg/ml，n=10）

注：与NC组比较，*P<0.05，与MC组比较，#P<0.05；与TPL组比较，ΔP<0.05

组别 TNF-α IL-4 IL-6 IL-17 NC组 36.30±2.85 9.39±0.87 26.59±2.93 30.94±2.954 MC组 188.33±23.67* 3.11±0.31* 83.64±5.71 93.43±5.89 TP组 78.71±6.39*#Δ 6.01±0.52*#Δ 40.87±6.37*#Δ 40.08±4.31*#Δ TPL组 103.42±8.38*# 4.62±0.42*# 61.41±6.88 52.91±3.12

2.2.2 雷公藤-白芍对AA大鼠滑膜组织p-PI3K、p-AKT蛋白表达的影响 与NC组大鼠比较，MC组大鼠的p-PI3K和p-AKT蛋白表达显著升高（P<0.05）；与MC组大鼠比较，TP组和TPL组大鼠的p-PI3K和p-AKT蛋白表达显著降低（P<0.05）；与TPL组大鼠比较，TP组大鼠的p-PI3K和p-AKT蛋白表达显著降低（P<0.05），见表4和图5。

表4 各组大鼠滑膜组织p-PI3K、p-AKT蛋白相对表达的比较（±s，n=10）

表4 各组大鼠滑膜组织p-PI3K、p-AKT蛋白相对表达的比较（±s，n=10）

注：与NC组比较，*P<0.05；与MC组比较，#P<0.05；与TPL组比较，ΔP<0.05

组别 p-PI3K p-AKT NC组 0.22±0.01 0.47±0.02 MC组 0.73±0.02* 0.91±0.01*TP组 0.37±0.01*#Δ 0.61±0.04*#Δ TPL组 0.62±0.01*# 0.82±0.01*#

图5 各组大鼠滑膜组织p-PI3K、p-AKT蛋白相对表达

3 讨论

RA的特点是免疫细胞和细胞因子作用于机体，激活破骨细胞、成纤维细胞及免疫复合物介导的补体等，导致细胞因子网络失调，引起炎症级联反应，产生慢性炎症[14]。因此，调节机体免疫、减少促炎因子分泌、减轻关节滑膜炎症是治疗RA的关键。

网络药理学表明，雷公藤-白芍所含成分复杂，可通过多靶点、多途径治疗RA。核心有效成分有抗炎和调节免疫等作用，对细胞因子及骨代谢平衡有调控作用[15-18]。TNF-α可作用于多条信号通路，调控IL-6和IL-4的分泌[19]；IL-4可通过抑制Th1介导的促炎作用，调节巨噬细胞的极化和活性，预防关节损伤和骨侵蚀，改善关节炎，促进组织修复[20]；IL-6可降低机体区分自我和非我的能力，刺激Th17途径，导致纤维化和炎症反应[21]。异常活化的PI3K/AKT信号通路可影响巨噬细胞极化，增加抗凋亡基因在滑膜细胞的表达，导致细胞因子分泌紊乱，滑膜纤维细胞过度增生[22-24]。动物实验显示，通过雷公藤-白芍治疗后可明显降低TNF-α、IL-6、IL-17及p-PI3K、p-AKT的表达，显著增加IL-4的分泌，表明雷公藤-白芍可有效抑制RA中的PI3K/AKT信号通路的过表达，恢复免疫平衡。

综上，本研究利用网络药理学发现雷公藤-白芍可通过多种有效成分影响多条信号通路和作用靶点，对RA产生治疗作用。动物实验表明，雷公藤联合白芍可通过调控PI3K/AKT信号通路干预下游相关细胞因子，对AA大鼠产生治疗作用，为雷公藤联合白芍治疗RA提供理论与实验依据。