基于隶属度综合分析法从制革固废中回收羊毛纤维

曹倩荣，吴芳彤，刘春卯，郑翔

（河北省微生物研究所有限公司，河北 保定 071051）

前言

由于人口、经济、时尚周期的变化，导致毛纤维消费品频繁的迭代[1]，全球纤维消耗量正在不断增长，造成了大量毛纤维原料缺口[2]。而反观皮革行业，皮革产业产生的毛纤维废弃物正在演变成一个全球性的问题，每年大约有上亿吨毛纤维废弃物被释放到环境中[3]，对环境造成损失[4]。有资料显示，将1 t 羊皮转化为皮革的过程中，会产生约100 kg 的羊毛废弃物[5]，这些羊毛以纤维蛋白和胱氨酸（7%～12%）为主要成分[6-7]，易腐败同时散发恶臭。目前这些废弃羊毛以焚烧和填埋为主，该处理方法不仅浪费了大量的优质毛纤维，而且会成为污染物的一部分，变成环境的负担。较为环保的处理方法是将毛纤维和表皮一并处理，如加工成饲料、化肥、工业用油[8-9]或降解后提取氨基酸等[10-12]，但该方法同样不利于毛纤维的高效再利用。因此，回收皮革产业废弃毛纤维，不仅能够有效改善制革企业的环境污染现状，同时还能部分缓解纺织行业的原料紧缺问题。

现阶段毛纤维回收工艺仍以人工刀剪为主，受原料整齐度影响较大，效率低，人工成本高，成品短毛率高，而且边角料中的血污、粪便会滋生大量细菌，对剪毛人员健康造成威胁。同时无论是传统的浸灰脱毛法，还是现代保毛脱毛法都不可避免地会出现硫化物的污染问题。因此，如何将制革固体废物的毛纤维进行完整回收，提高毛纤维废弃物的利用率，使之向高值化方向发展，同时避免硫化物的二次污染，成为该领域需要思考和解决的问题[13]。

张春华等综述了近年来国内外回收羊毛纤维的环保方法。此类工艺主要是将羊毛纤维利用机械或化学的方法进行处理，回收羊毛粉、角蛋白等，进而在纺织、生物吸附剂、化妆品等领域进行应用[14]。罗同阳等对制革含兔毛固废提取毛纤维工艺进行了正交优化，其响应值分别为脱毛率和残余酶活，并对其进行了综合分析[15]。目前，在评价制革固废处理工艺效果时，通常采用单因素评价法或者正交法，用其中某个单一指标进行评价，如水解率、残余酶活或转化率等。当其产物性能涉及毛纤维白度、断裂强度、断裂伸长率、水解液蛋白含量等多种因素时，缺少一种综合评价方法将多种性能指标作为整体来对工艺进行评价。

隶属度综合评价法属于模糊评价范畴，是指某个元素或变量对于不同评价等级的归属程度。它用于描述模糊集合中元素与各评价等级之间的关系。基于隶属度的综合分析法现已广泛应用于水利、环境等学科的相关研究中[16-17]。近年来有学者将隶属度综合分析法应用在食品科学领域，更全面地评估产品工艺优化等过程中食品品质等指标[18]。

本研究以不同酶解条件为研究对象，对酶解所得毛纤维白度、纤维断裂强度、纤维断裂伸长率和水解液总蛋白含量、总糖含量进行加权，建立隶属度综合评价方法，获得反映其酶解性能的综合评分S，以综合评分S 为响应值，通过响应面分析法设计实验，优化得出最优毛纤维提取工艺。

1 主要材料和仪器

1.1 主要材料

羊皮：来源于制革工业区的国产含毛羊皮边角废弃物。

1.2 试剂

考马斯亮蓝染色液、标准牛血清白蛋白（BSA）：北京索莱宝科技有限公司

胶原酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶：上海麦克林生化科技有限公司

硫酸、苯酚、葡萄糖、氢氧化钠均为国产分析纯。

1.3 仪器设备

TU-1901 双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；JAZ003A 天平：天马衡基仪器有限公司；ZWY-240 恒温（全温）培养摇床：上海智诚分析仪器制造有限公司；GI 热泵循环不锈钢控温转鼓：无锡市德润轻工机械厂；WSB-3A 型智能式数字白度计，YG（B）001A 型电子单纤维强力机：温州市大荣纺织仪器有限公司。

2 实验方法

2.1 毛纤维回收工艺

2.1.1 固废处理方法

取2 cm×2 cm 含毛羊皮块，加入到含水100 mL的250 mL 锥形瓶中，80 ℃高温水浴处理1 h。冷却体系温度至35 ℃，加入酶制剂20 000 U，在35 ℃、50 r/min 条件下进行处理，待皮块彻底水解后，过滤、分离毛纤维，将毛纤维洗净，自然晾干，测定羊毛样品的白度、纤维断裂强度和纤维断裂伸长率；取水解液5 mL，10 000 r/min 离心，取上清液测定总蛋白含量和总糖含量。

2.1.2 酶制剂单因素筛选

分别用胶原酶、碱性蛋白酶、纤维素酶、胰酶、菠萝蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶代替2.1.1 毛纤维提取工艺中的酶制剂，测定不同酶制剂处理后羊毛样品的白度、纤维断裂强度、纤维断裂伸长率和水解液中总蛋白含量、总糖含量。以隶属度综合分析法进行计算，获得综合评分S，筛选综合评分S在0.5以上的酶制剂进行复配。

2.1.3 响应面优化

将单因素筛选获得的酶制剂进行复配，通过Box-Behnken 中心组合实验设计优化不同酶制剂的添加量，以每组试验中毛纤维白度、断裂强度、断裂伸长率和水解液中总蛋白含量、总糖含量5 个指标的数据进行隶属度综合分析，以综合评分S为响应值，运用Design-Expert10 软件进行实验设计和数据分析，建立回归模型。

2.1.4 工艺参数

探究不同初始pH 值5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 和10.0，酶解温度20、25、30、35、40 和45 ℃，酶解时间2、3、4、5、6 和7 h，对毛纤维白度、断裂强度、断裂伸长率和水解液中总蛋白含量、总糖含量5 个指标进行测定，通过隶属度综合分析法计算获得综合评分S，获得最佳酶解工艺。

2.1.5 隶属度综合评分法

运用隶属度综合评分法，将回收毛纤维的白度、断裂强力、断裂伸长率和水解液中总蛋白质含量、总糖含量5 项指标对毛纤维质量及水解效果进行综合评分。其隶属度按公式（1）计算[19]。

式中，Ci为指标值；Cmin为最小值；Cmax为最大值。

按公式（2）进行加权得到综合评分S。

式中，L1为毛纤维白度隶属度；L2为毛纤维断裂强度隶属度；L3为毛纤维断裂伸长率隶属度，L4为水解液总蛋白含量隶属度，L5为水解液总糖含量隶属度；a、b、c、d、e为各指标权重。由于本实验进行酶制剂筛选的主要目的是回收具有经济价值的毛纤维，以毛纤维的综合质量为评价指标，其中纤维白度、断裂强度、断裂伸长率为毛纤维的重要评价因素，因此，a=0.25，b=0.25，c=0.25。在获取毛纤维的同时，皮蛋白的水解程度是衡量酶制剂效率的重要因素，当皮蛋白水解程度高时，废弃皮料中的毛纤维更容易提取出来，提取效率越高，复合酶制剂越不容易对毛纤维造成损伤。而水解液中的蛋白含量、总糖含量是衡量皮蛋白水解程度的重要量化指标。同时在水解机理中，酶直接作用于糖蛋白中的核心蛋白质分子，而糖类是由于蛋白质的水解释放的分子，因此以总蛋白质含量为主要指标，总糖含量为次要指标，于是取d=0.2，e=0.05[20]。

2.2 检测方法

2.2.1 白度测定

依据国家标准GB/T 17644-2008《纺织纤维白度色度试验方法》测定[21]。

用白度计在同一色温光源的照射下，以标准白度板为基准，对毛纤维进行反射率的对比测定。

2.2.2 断裂强度和断裂伸长率测定

毛纤维作为加工原材料，在制成成品的过程中会不断受到外力的作用，而毛纤维的力学性能是衡量制品耐用性的重要指标，纤维断裂强力、断裂强度和断裂伸长率是测定纤维受外力拉伸至断裂时所需要的力和产生的变形。用等速伸长方式拉伸单根纤维，直至断裂，通过电子单纤维拉力机测定纤维断裂强力和断裂伸长，由断裂强力和线密度计算出断裂强度。其中试样加持长度为20 mm，拉伸速度为10 mm/min，样本容量为30（考虑到纤维变异系数较大，在选择时，首先预挑选，把太细或太粗的剔除）[22-23]。

2.2.3 蛋白含量的测定

毛根周围蛋白质的水解，导致了毛纤维的脱落，其水解产物随着毛纤维的脱落而同时进入脱毛液中，因此可溶性蛋白水解产物的产生与浓度的变化可用来标志毛纤维的脱落程度[24]。

取100 μL 5 mg/mL 的BSA 加入2.4 mL 的磷酸盐缓冲液中，稀释至质量浓度为0.2 mg/mL，作为工作液，将工作液按比例释成不同浓度稀释液，以考马斯亮蓝为染色液，在A595处测得吸光度，根据吸光度与蛋白浓度成正比的关系，得到蛋白含量标准曲线。

测定酶解上清液中总蛋白含量时，将样品稀释至合适倍数，采用考马斯亮蓝法[25]以待测样品代替BSA 标准品测定A595处吸光度，计算蛋白质含量。

2.2.4 总糖含量的测定

糖在浓硫酸的作用下先水解为单糖，之后迅速脱水生成糖醛或羟甲基糖醛。此类糖醛衍生物能与苯酚缩合生成橙红色化合物。该化合物在485 nm波长下有最大吸收峰，且在10～100 ng 范围内，其颜色深浅与糖的含量成正比。基于此原理，可用比色法在485 nm 波长下进行测定。

以葡萄糖溶液为标准品，将10 mg/mL 葡萄糖标准溶液用蒸馏水稀释至1、0.8、0.6、0.4、0.2 和0.1 mg/mL 标准稀释液，然后分别加入5%苯酚溶液0.5 mL，摇匀，快速加入2.5 mL 浓硫酸，充分振摇，于25～30 ℃放置20 min，以空白为参比调零，于485 nm 处测吸光度，得到总糖含量标准曲线。

测定酶解上清液中总糖含量时，将样品稀释合适倍数，吸取1 mL 稀释液，将稀释液与1 mL 5%苯酚、5 mL 浓硫酸在25～30 ℃反应20 min，于485 nm测定其吸光度。根据标准曲线将吸光度值折合为总糖含量[26]。

3 结果与分析

3.1 酶制剂单因素结果

不同酶制剂作用下，毛纤维质量和酶解效率见图1。脂肪的存在容易增加纤维的保水性能，增强其柔韧度和抗拉强度，胶原酶、菠萝蛋白酶等未破坏纤维表面的油脂层，因此其纤维断裂强度稍强。

图1 不同酶制剂作用下毛纤维质量和酶解效果Fig.1 The quality of hair fibers and enzymatic hydrolysis efficiency treated with different enzymes

加入碱性蛋白酶和纤维素酶后，毛纤维白度明显较差，胶原酶效果较好，其它酶制剂效果相当。这很可能是因为所使用的碱性蛋白酶自身颜色较深，该酶制剂颗粒较细，非常容易附着在毛纤维上，并且不易清洗掉，导致的毛纤维白度较差。

使用的酶制剂对毛纤维本身没有大的损伤，经隶属度综合分析法计算获得不同酶制剂作用效果的综合评分值S，选取综合评分在0.5 以上的胶原酶、菠萝蛋白酶和胰酶作为脱毛酶制剂。

非特异性的蛋白酶对毛根及表皮和真皮界面处的非胶原蛋白的水解作用是引起毛纤维脱落的主要原因，同时胶原酶对胶原纤维的交联区域及交联结构有较强的破坏能力，这种破坏将产生纤维溶解作用，导致羊皮的机械强度和热稳定性下降，胶原酶对毛纤维的脱落有一定的促进作用[27]，因此选取菠萝蛋白酶、胰酶和胶原酶进行复配能协同提高制革含毛固废物中毛纤维的提取效果。

3.2 响应面优化复合酶配比

3.2.1 中心组合因素设计及结果

结合单因素试验结果，选取胶原蛋白酶（A），胰蛋白酶（B），菠萝蛋白酶（C）为自变量，经隶属度综合评分法计算所得综合评分S为响应值，综合评分S可反映毛纤维白度、纤维断裂强度、纤维断裂伸长率和水解液中总糖含量、总蛋白含量的综合情况，通过Design-Expert 10 软件完成响应面中心组合设计，对复合酶配比加以优化。因素水平及编码表见表1。

表1 响应面分析因素与水平表Tab.1 Factors and code levels of experiments

CCD 中心组合设计20 试验组中毛纤维白度、纤维断裂强度、断裂伸长率和水解液中总糖含量、总蛋白含量检测结果见图2，根据隶属度综合分析法，按照各因素权重进行汇总，得到酶制剂不同配比条件下的综合评分S，见表2，通过多元模拟拟合分析，得到不同酶制剂配比对综合评分S的二次多项式回归方程：

图2 CCD 中心优化组合设计各组毛纤维质量和酶解效率Fig.2 Hair fiber quality and enzymatic hydrolysis efficiency of CCD center optimization combination design

3.2.2 响应面分析

对该模型的显著性进行分析，结果如表3 所示，回归模型F=6.42，P＜0.001 极显著，失拟项为P=0.080，失拟不显著，表明该模型能够较准确地反应不同配比酶制剂与毛纤维质量和酶解效率的综合评分的关系。负相关系数R2=0.8526，校正决定系数Radj2=0.7199，表明试验所得值与预测值相关性较高，可以由此模型对酶制剂配比与毛纤维质量和酶解效率综合评分S进行分析和预测。其中A（胶原酶）和B（胰蛋白酶）的交互作用显著，失拟项不显著，表明未知因素对实验结果影响较小。

表3 二次回归模型方差分析表Tab.3 Quadratic regression model analysis of variance table

根据回归方程，作出响应面和等高线，考察拟合响应曲面的形状，如图3 所示，可直观反映胶原酶、胰蛋白酶和菠萝蛋白酶三个因素之间的相互作用对毛纤维提取工艺综合综合评分S 的影响。

图3 交互作用响应面图和等高线图Fig.3 Response surface and contour maps of interactions

图4 pH、温度和酶解时间对毛纤维提取效果的影响Fig.4 The effects of pH, temperature and enzymolysis time on the extraction of wool fiber

等高线的形状可直接反映出交互作用的强弱，由等高线的形状可以看出，各因素的等高线均为近似椭圆形，说明各因素之间存在交互作用。在胶原酶不变的情况下，随着胰蛋白酶和菠萝蛋白酶的增加，溶液中的总蛋白含量、胶原蛋白含量、总糖含量和毛纤维白度、纤维断裂强度、纤维断裂伸长率的综合评分呈上升趋势直至最高点，但胰蛋白酶和菠萝蛋白酶的含量过大，也会导致综合隶属度小幅度下降，胰蛋白酶与菠萝蛋白酶都是非特异性蛋白酶，其作用位点都位于表皮和真皮中类粘蛋白部分，同时其本身也为蛋白结构，含量过大可能会引起部分相互水解作用，导致效果较预期小幅下降；在胰蛋白酶含量不变的情况下，胶原蛋白酶和菠萝蛋白酶添加量的升高，有利于综合隶属度的提升，可能是因为在胰蛋白酶起主要作用的脱毛过程中，胶原蛋白酶含量的增加，可加速脱毛进程[28]，但过高的含量也会对酶活保存率的提升产生不利影响。

通过响应面软件分析计算得出的最优配比为：胶原蛋白酶2.5 g/L，胰蛋白酶2.5 g/L，菠萝蛋白酶5 g/L。为了验证预测值，在这个点做重复实验，3 次实验的总蛋白含量、胶原蛋白含量、总糖含量和毛纤维白度、纤维断裂强度、纤维断裂伸长率数据代入响应面评价数据中，其综合隶属度为0.838，基本与数学模型得到的最大酶活保存率符合，说明响应面法优化得到的数学模型与实验数据拟合较好。

3.3 pH 对毛纤维提取效果的影响

由文献可知，不管是哪种毛纤维提取方式，关键是脱毛过程中酶的渗透、酶的活性以及酶与皮中有效成分的反应等。因此，确定对酶活有较大影响的pH 非常重要，只有在适当pH 条件下，酶才有最大活性[29]。由表4 可见，当溶液处于酸性时，胰蛋白酶、菠萝蛋白酶较稳定，但是酶活力较低，pH为7 时，酶活力最高，其隶属度综合评分S最高，为0.924，当溶液碱性较大时，胰蛋白酶和菠萝蛋白酶等酶制剂不可逆失活，其酶解作用丧失，使溶液中蛋白浓度较低。同时，溶液碱性较大时，毛纤维柔韧性降低，纤维断裂强度低，毛纤维更脆，不符合毛纤维使用要求。综合毛纤维白度、纤维断裂强度、断裂伸长率以及水解效率分析，此时水解液的初始pH 为7 为最佳条件。

表4 不同初始pH 条件下隶属度L 值Tab.4 Membership L values under different initial pH conditions

3.4 温度对毛纤维提取效果的影响不同温度条件下隶属度L 数值

如表5 所示，在40 ℃以下，随着温度的升高，酶制剂的活性逐渐增大，水溶液中蛋白浓度和总糖浓度逐渐增大。同时，随着温度增高，分子不规则运动加剧，毛纤维上附着的杂质含量越少，毛纤维的白度逐渐增大，毛纤维的断裂强度和断裂伸长率随温度升高也有所提升。但在40 ℃以上，随着温度升高，综合评分逐渐降低。只有水解温度为40 ℃时，其综合评分最高，为0.829，此时水解温度为最佳条件，这是因为起脱毛关键作用的胰蛋白酶在35～45 ℃范围内具有较高的酶活力及稳定性[30]。

表5 不同温度条件下隶属度L 值Tab.5 Membership L values under different temperature conditions

3.5 酶解时间对毛纤维提取效果的影响

如表6 所示，随着时间的延长，酶反应更加充分，其水解液中蛋白含量越多，综合隶属度越大。但是因为酶反应液中未加入防腐剂等抑制细菌增长，当时间过长时，溶液中以蛋白为生长物质的菌体大量繁殖，导致溶液中蛋白含量降低，溶液产生异味，因此根据隶属度综合分析，当水解时长为5 h 时为最佳时长。

表6 水解不同时间隶属度L 值Tab.6 Membership L values under different hydrolysis time

3.6 验证试验

软件Design-Expert10 分析计算最佳酶制剂配比为：胶原蛋白酶2.5 g/L，胰蛋白酶2.5 g/L，菠萝蛋白酶5 g/L。通过对酶解工艺进行优化，获得最佳酶解工艺条件为：初始pH 为7、温度40 ℃，时间5 h。采取上述提取工艺，如图6 所示，选择3 批样品进行毛纤维提取试验，测定毛纤维白度为61%，纤维断裂伸长率为33%，较原毛均有所提升，纤维断裂强度为1.08 cN/dteX，为原毛的96%，验证结果表明，优选的提取工艺与理论值相符。

4 结论

利用隶属度将回收羊毛纤维的白度、断裂强力、断裂伸长率和水解液的总蛋白质含量、总糖含量5 项指标进行赋权，获得综合评价方法；结合响应面优化法进行实验设计，获得毛纤维提取的最佳酶制剂配比为胶原蛋白酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶的添加量比例为2∶1∶1；继续对酶解工艺进行优化，获得最佳工艺条件为：含毛制革固废80 ℃高温水浴1 h，冷却后浸入含有胶原蛋白酶2.5 g/L、胰蛋白酶2.5 g/L、菠萝蛋白酶5 g/L 的溶液中，以NaOH溶液调节pH 至7.0，40 ℃酶解5 h，过滤洗涤，提取毛纤维。验证实验的结果与理论预测值相符较好，本研究建立了隶属度综合评价法与响应面优化法在制革固废毛纤维提取工艺上的研究方法，有利于更全面地评估制革固废处理工艺及处理效果。

获取废弃羊毛纤维应用于纺织行业不仅能够避免过多的制革生皮废料产生，还能对其进行高值化利用，满足我国羊毛纤维短缺的现状。用酶法提取毛纤维是一种清洁高效的处理方式，在制革废弃物的高价值回收利用上将发挥越来越重要的作用。