应用液质联用与分子对接技术筛选黑参中的活性寡肽

高晓晨，申嘉明，王跃龙，程端端，吴佩潼，王硕，张辉，孙佳明

（长春中医药大学吉林省人参科学研究院，吉林 长春 130117）

糖尿病（Diabetes）是一种以慢性高血糖症状为主要特点的终身性代谢疾病[1]，临床常用胰岛素类、促胰岛素分泌类、-葡萄糖苷酶抑制剂和胰岛素增敏剂等药物进行治疗[2]；阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease,AD）是一种慢性、快速进展的神经退行性疾病[3]，目前临床常采用M 型胆碱能受体激动剂、胆碱酯酶抑制剂、抗氧化和抑制淀粉样蛋白沉积药等药物来治疗阿尔兹海默病[4]。以上治疗药物常存在有引起不良反应和治疗效果不理想等问题[5]。中药治疗慢性疾病具有效果好、副作用小的优点，而中药的小分子肽因其来源广泛、安全高效而倍受关注，因此从中药中筛选出天然的生物活性肽，在抗阿尔茨海默病和糖尿病方面将会具有独特的优势。

黑参（Black ginseng）为五加科人参属植物人参（Panax ginseng C.A.Mey.）的干燥根及根茎，经九蒸九晒炮制或结合微生物发酵而成[6]，多含Rh2、Rh3、Rg3和Rk1 等稀有皂苷成分[7]，具有抗肿瘤、抗炎、降压保肝、抗糖尿病和中枢神经系统保护等药理作用[8]。Lee等[9]在研究高丽白、红和黑参提取物对胆碱酯酶（ACE）抑制活性和胆碱能功能的比较中发现，黑参可以调节乙酰胆碱（ACh）的代谢，对胆碱酯酶的抑制作用最强。Seo 等[10]通过给糖尿病小鼠灌服黑参提取物，发现黑参提取物可通过增加葡萄糖的摄取而降低血糖，从而治疗糖尿病。目前，对黑参有效成分的研究多集中于稀有皂苷方面，而对黑参肽的药理活性报道较少。

为了在黑参中筛选活性寡肽类成分，本研究通过超高效液相色谱-线性离子阱-静电场轨道阱高分辨质谱和分子对接技术分析黑参精制组分中抑制乙酰胆碱酯酶和-葡萄糖苷酶的活性寡肽类成分，并预测它们与乙酰胆碱酯酶和-葡萄糖苷酶的对接结合能和对接模式。与传统筛选研究方法相比，液质联用与分子对接技术相结合不仅可以提高筛选的效率，而且可为黑参寡肽类成分的作用机制的推测和阐述提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

黑参药材由长春中医药大学吉林省人参科学研究院自制。UltiMate 3000 series 高效液相色谱仪、超高效液相色谱线性离子阱-静电场轨道阱高分辨质谱仪，美国Thermo Fisher 公司；BP211D 型十万分之一电子天平，北京赛多利斯天平有限公司；KQ3200BE超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；LDZX-30KBS立式高压蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；GZX-9070MBE数显鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

甲醇（分析纯，20220309），国药集团化学试剂有限公司；乙腈、甲酸（色谱纯），赛默飞世尔科技（中国）；Flash SphericalC8填料，天津博纳艾杰尔科技有限公司。

1.2 样品制备

将干燥的5 年生的人参置于高压灭菌锅中在120℃的温度条件下蒸制2 h后，放入鼓风干燥箱50 ℃干燥8 h，继续重复操作循环蒸制干燥8 次，得到黑参，置于阴凉干燥处贮藏。

取10 g 黑参饮片，用50%乙醇（质量比1:10）超声提取，每次60 min，共2 次，将合并的提取液加压回收乙醇至无醇味，加适量超纯水定容到100 mL。

甲醇1 mL 活化C8 固相萃取（SPE）小柱，用水1 mL 平衡。将上述水溶液样品1 mL 上柱，收集漏出液，用水1 mL 洗脱杂质，用30%甲醇1 mL 洗脱，收集洗脱液，作为黑参精制组分样品溶液，经0.45m微孔滤膜过滤，供超高效液相色谱线性离子阱静电场轨道阱高分辨质谱仪分析。

1.3 黑参精制组分的液质分析

色谱条件：采用UnitaryC18 色谱柱（4.6mm 150mm，2.8m 100）；流动相为乙腈（A）和0.1%的甲酸水溶液（B），通过二元线性梯度洗脱，流动相梯度：0～30 min（10%～100%A），流速0.5 mL/min；进样量10L；柱温30 ℃。

质谱条件：采用电喷雾电离源（ESI），样品采用正离子模式扫描。喷雾电压2.5 kV，毛细管温度350 ℃，透镜电压50 eV，鞘气压力2.76×105Pa，辅助气压力6.89×104Pa，辅助气温度300 ℃，分辨率70 000，质量扫描范围m/z 100～1 500。

1.4 分子对接

使用ChemDraw 20.0 绘制黑参中寡肽类成分的sdf 2D 结构的分子式，通过Chem 3D 软件能量最小化，转换为柔性结构的pdb格式，使用OpenBabel 2.4.1确认可旋转的键并保存为pdbqt 格式，以备后续对接使用。

通过RSCB PDB 数据库（http://www.rcsb.org/）下载乙酰胆碱酯酶的晶体结构（4EY6）和-葡萄糖苷酶（2QMJ）的pdb 格式文件，经PyMOL 对其进行去水、加氢等操作，使用Autodock 保存为pdbqt 格式。通过查询文献[11,12]确定乙酰胆碱酯酶的结合位点坐标（4EY6，2.827，40.098，30.802）及尺寸（26×26×26）和-葡萄糖苷酶的结合位点坐标（2QMJ，21.56，6.936，1.971）及尺寸（26×26×26），并按照相关格式保存为txt 格式，寡肽所有可旋转键均设为柔性，乙酰胆碱酯酶和-葡萄糖苷酶设置为钢性，搜寻精度exhaustiveness设为64，格点间距1，其他参数默认，运行Autodock Vina，采用拉马克遗传算法对接运算100 次。将结果用LigPlus 和PyMOL 程序对对接构象进行可视化分析。

2 结果与讨论

2.1 黑参精制组分的液质分析

用甲醇溶液配制浓度为1 mg/mL 的黑参精制组分样品溶液，过0.22m 膜，经超高效液相色谱线性离子阱静电场轨道阱高分辨质谱分析，得到正离子模式下的总离子流图，见图1。结合各色谱峰的分子离子峰及主要碎片峰的解析、与文献[13-15]对比，指认了其中5 个寡肽类成分，结果见表1。

图1 为黑参精制组分化合物的正谱总离子流图，指认出5 个寡肽类化学成分，分别为谷氨酸天冬酰胺（Glu-Asn），酪氨酸天冬酰胺（Tyr-Asn），亮氨酸甲硫氨酸（Leu-Met），脯氨酸甲硫氨酸（Pro-Met），苏氨酸苯丙氨酸（Thr-Phe）。

2.2 分子对接结果

表2 5 个寡肽与乙酰胆碱酯酶和-葡萄糖苷酶的结合情况Table 2 Binding of five oligopeptides to acetylcholinesterase and-glucosidase

表2 5 个寡肽与乙酰胆碱酯酶和-葡萄糖苷酶的结合情况Table 2 Binding of five oligopeptides to acetylcholinesterase and-glucosidase

一般认为配体和受体分子对接的结合能小于0，便可以自发结合，结合能越小发生相互作用的可能性越大[16]。从表2 可以看出，黑参中的5 个寡肽化合物与乙酰胆碱酯酶和葡萄糖苷酶的结合能均小于0，说明5 个寡肽类化合物均可以与两种酶自发结合。同时5 个寡肽的结合能均小于20.9 kJ/mol，表明黑参寡肽可能具有良好的乙酰胆碱酯酶和糖苷酶抑制活性。通过对比两者发现，5 个寡肽成分与糖苷酶的结合能普遍低于乙酰胆碱酯酶，表明黑参可能对糖苷酶的抑制作用更好。其中酪氨酸天冬酰胺相较于其他寡肽对两种酶的分子对接结合能更小，提示酪氨酸天冬酰胺可能具有良好的抗阿尔茨海默病和糖尿病活性。

3 结论