葛花菊花水煎液中总黄酮含量的测定方法研究

权春梅,李金富,马省委,曹帅,修慧迪,李媛媚,李扬,汪兰兰

(1.亳州职业技术学院 药学院,安徽 亳州 236800;2.安徽万花草生物技术公司,安徽 亳州 236800;3.亳州学院 中药学院,安徽 亳州 236800;4.安徽中医药大学 药学院,安徽 合肥 230000)

葛花是豆科植物野葛(PuerariaLobata(Willd.)Ohwi)或甘葛藤(Pueraria.thom-soiiBeeth.)的未开放的干燥花。《神农本草经》等记载葛花是传统的中药解酒药物,具有解酒醒脾的功效,主要治疗酒后引起的呕逆吐酸、发热烦渴、吐血、 肠风下血等症状。常用于伤酒烦热口渴、头痛头晕、呕吐吞酸、脘腹胀满、不思饮食、吐血,肠风下血等症状[1]。从古至今葛花被广泛地应用于解酒领域,在解酒方面可谓是有着独领风骚的地位。在《圣济总录》中记载葛花散:葛花一两。上一味,捣为散,沸湯点一大钱匕,不拘时候,亦可煎服[2],来治饮酒中毒。《别录》也有:“主消酒[3]。”近些年科研工作者对葛花的研究越来越多,发现葛花在解酒方面具有很高的药用价值,葛花所含的化学成分较多,目前发现的主要有黄酮类、皂苷类、挥发油类、甾醇类、生物碱和氨基酸等,其中黄酮类化合物的含量相对最高[4]。葛花含有丰富的皂角苷、异黄酮能有效地抑制肠胃对酒精的吸收,促进血液中酒精代谢和排泄[5]。此外,葛花中的鸢尾素可以抑制β-葡萄糖醛酸酶的活性,并且能恢复谷胱甘肽巯基转移酶和谷胱甘肽的活性,起到保护肝脏的作用[6]。

菊花为菊科植物菊(ChrysanthemummorifoliumRamat.)的干燥头状花序,性味甘、苦,微寒;归肺、肝经,具有散风清热、平肝明目、清热解毒;常用于头痛眩晕、目赤肿痛、眼目昏花、疮痈肿毒等[7]症状。其化学成分较复杂,最主要的有效成分为黄酮类、挥发油和三萜类化合物;具抗氧化、抑菌、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗衰老耐疲劳、肝保护等作用[8-10]。

明代医家杜文夑撰在《药鉴》记载医方“(菊花)…解醉汉昏迷,易醒,共干葛(宜葛花)煎汤。”此方是将葛花和菊花在一起用水煎法制备葛花菊花水煎液,口服,来治疗醉酒。而在葛花和菊花中,黄酮类物质是两者共有的成分,也是解酒的关键成分,因此,研究葛花菊花水煎液中总黄酮的含量对于研究该方的解酒机理和功效具有重要的意义。

目前适用于葛花总黄酮的含量测定方法有:分光光度法[11]、高效液相色谱法[12]、薄层色谱法[13]、毛细管电泳法[14]。分光光度法又包括可见分光光度法和紫外分光光度法。该法无需特别复杂的仪器设备,操作快捷方便,应用广泛。本文主要是利用分光光度法对葛花菊花水煎液中总黄酮含量的测定方法进行研究,通过对比测量葛花水煎液中总黄酮浓度的不同方法,选择适宜的测量葛花菊花水煎液中总黄酮浓度的方法。该研究为利用古方开发葛花菊花解酒功能饮料打下了基础。

1 试验器材与试剂

1.1 材料和试剂

葛花(购自亳州康美中药材市场),经亳州职业技术学院程翔老师鉴别为野葛的花;亳菊花采收于安徽省亳州市谯城区小李村,经亳州职业技术学院程翔老师鉴定为亳菊的花,并将其阴干储存备用。芦丁标准品:江苏永健医药科技有限公司( 批号: 200226-210404z);鸢尾苷标准品:江苏永健医药科技有限公司(批号:200153-160806);无水乙醇(国药集团有限公司); 纯净水(合肥娃哈哈饮料有限公司)。其他试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器

全自动煎药锅(广东萌圈科技有限公司);UV-5900PC型紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司);天平(上海菁海仪器有限公司,FA21048);AE224C型电子计重计数天平(上海舜宇恒平科学仪器科技有限公司);移液器。

2 实验方法

2.1 可见分光光度法(显色法)测定

2.1.1 样品溶液的制备

称取葛花和菊花各10 g,置于全自动煎药锅中,加水700 mL浸泡30 min,设置煎煮时间为42 min,水煎后得到葛花菊花水煎液,过滤,即制得样品原溶液。由于样品原溶液的颜色较深,因此,需要稀释。准确取样品原溶液1.00 mL置于100 mL容量瓶中,加纯化水稀释至刻度,即得样品溶液。

2.1.2 芦丁对照品溶液的制备

称取15.3 mg芦丁对照品置100 mL容量瓶,用70%乙醇溶解至刻度处,即得0.153 mg/mL的对照品溶液。

2.1.3 显色溶液的配制及显色

10%硝酸铝:精密称量5 g的Al(NO3)3,在小烧杯中用纯化水溶解,移至50 mL容量瓶中定容至刻度线处。

5%亚硝酸钠:量取2.5 g的NaNO2,在小烧杯中用纯化水溶解,移至50 mL容量瓶定容至刻度线处。

4%氢氧化钠:量取2 g的NaOH,在小烧杯中用纯化水溶解,至50 mL容量瓶定容至刻度线处。

样品溶液和对照品溶液的显色:准确量取样品溶液和对照品溶液各1 mL,按NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法,在10 mL容量瓶中依次添加显色剂,然后在可见光范围内分别对样品溶液和对照品溶液进行光谱扫描。

2.2 紫外分光光度法

2.2.1 以芦丁为对照品的紫外分光光度法测定

芦丁对照品溶液的制备:准确取“2.1.2”中的芦丁对照品溶液1.00 mL置10 mL容量瓶,用70%乙醇溶液定容至刻度。

样品溶液的制备:同“2.1.1”样品溶液的制备。

将芦丁对照品溶液和样品溶液在紫外光范围内进行光谱扫描。

2.2.2 以鸢尾苷为对照品的紫外分光光度法

鸢尾苷对照品溶液的制备:取鸢尾苷对照品2.0 mg用50%乙醇制成每1 mL含0.04 mg的溶液,得鸢尾苷对照品溶液。

样品溶液的制备:同“2.1.1”样品溶液的制备。

将样品溶液和鸢尾苷对照品溶液在紫外光范围内进行光谱扫描。

3 结果与分析

3.1 可见分光光度法(显色法)试验结果

通过对比芦丁对照品溶液和样品溶液显色后在可见光区波长范围内的吸收曲线的特征(见图1),来确定以芦丁对照品的显色法是否合适测定样品溶液中总黄酮的含量。结果表明芦丁对照品显色后在506 nm处有吸收峰位,而样品溶液在可见光范围内无吸收峰位。由此判断该可见分光光度法中不适用于测定样品溶液中总黄酮的含量。

图1 芦丁与样品显色后的溶液吸收光谱图

3.2 紫外分光光度法试验结果

3.2.1 以芦丁为对照品的试验结果

通过对比图2中芦丁对照品溶液与样品溶液在紫外光的波长范围内是否具有共同的峰位,确定芦丁对照品的紫外分光光度法是否适用于测定葛花菊花水煎液中的总黄酮。结果表明芦丁对照品溶液在258 nm处有最大峰值,而样品溶液在264 nm处有最大吸收峰值。两者的吸收峰位相差6 nm。因此,如果以芦丁对照品的紫外分光光度法来测定葛花菊花水煎液中的总黄酮,可能会因为两者吸收峰位的差距造成测定误差的增大。

图2 芦丁对照品溶液、鸢尾苷对照品额与样品溶液的吸收光谱图

3.2.2 以鸢尾苷为对照品的试验结果

通过对比图2中鸢尾苷对照品溶液与样品溶液在紫外-可见光区范围内的光谱吸收,得知鸢尾苷对照品溶液和样品溶液在波长264 nm有吸收峰,两者吸收峰位一致。表明了以鸢尾苷对照品的紫外分光光度法最适用于葛花菊花水煎液中的总黄酮含量的测定(见图2)。

3.3 方法学考察

3.3.1 入射光波长的确定

通过图2得知鸢尾苷对照品溶液和样品溶液均在波长264 nm有吸收峰,因此,把264 nm作为入射光的波长。

3.3.2 精密度试验

用“2.1.1”样品溶液,以纯化水作参比溶液,在最大波长264 nm处连测6次样品溶液的吸光度,并记录每次测量结果,计算标准偏差(RSD)。试验结果如表1,经过精密度实验,RSD为0.11%(<5%)。表明用该方法测定葛花水煎液具有良好的精密度,符合含量分析的要求。

表1 精密度试验结果(n=6)

3.3.3 稳定性试验

取“2.2.2”项下的鸢尾苷对照品溶液和“2.1.1”样品溶液,在最大波长264 nm处每隔10 min分别各测定一次吸光度,共测6次,并将测量的吸光度值记录下来,以此计算标准偏差(RSD),具体数据见表2。经比较发现鸢尾苷对照品溶液与葛花菊花水煎液的相对标准偏差均为0.05 (<5% ) ,本实验说明该对照品溶液与葛花菊花水煎液在60 min内的稳定性良好。

表2 稳定性试验结果(n=6)

3.3.4 重复性试验

取“2.1.1”下样品溶液,在最大波长264 nm处该样品溶液的吸光度值。并记录每次测量结果,计算标准偏差(RSD)。实验结果如表3。经实验测试,发现这种方法的准确度为0.11% ,表明其重复性较好。

表3 重复性试验结果(n=6)

4 结论

通过对比以上三种方法,结果表明NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色的可见分光光度法不适用葛花菊花水煎液中总黄酮的含量测定;紫外分光光度法中芦丁对照品与样品溶液吸收峰位存在一定的差距,也不是特别适合用来测定葛花菊花水煎液中总黄酮的含量。而鸢尾苷标准品与样品溶液的吸收峰基本一致,通过精密度、稳定性、重复性试验证明该法符合方法学考察的要求,由此确定以鸢尾苷作为对照品的紫外分光光度法比较适合测定葛花菊花水煎液中总黄酮的含量。