冻结过程中面团水分均匀度及面筋蛋白网络结构变化规律研究

张艳艳,吴昊,白冰洁,张普,谷瑞丽,张华

1.郑州轻工业大学 食品与生物工程学院/冷链食品加工与安全控制教育部重点实验室,河南 郑州 450001;2.中原食品实验室,河南 漯河 462300;3.河南省食品和盐业检验技术研究院 国家市场监管重点实验室, 河南 郑州 450003

0 引言

冷冻处理是一种常用食品保藏技术,具有易保藏、易运输等特点,被广泛应用于中国传统面制品加工生产中[1]。然而,冷冻处理会使面团品质下降,主要表现为面团持气能力、持水能力和弹性下降,黏性和硬度增加,面团内部孔隙变大,面筋结构变差,等等[2-3]。水作为面筋蛋白与淀粉交联作用的介质,其含量、物理状态、位置等对最终产品品质的影响至关重要[4]。面粉加水后,经混合搅拌形成面团,再经一段时间的静置,可使面团组分的交联分布更均匀、更稳定[5-6]。但在冷冻过程中,原本均匀分布在面团中的水分会发生迁移,水分子与蛋白质间的相互作用被破坏,水分不断向细小的冰晶迁移靠近,使得面团微孔内的冰晶不断生长变大,而大冰晶会刺破面团组织,破坏面筋蛋白网络结构,导致面团品质劣变[7]。

目前,研究者主要关注冷冻后、储藏过程中及添加改良剂后面团的品质[8-10],如陈丽等[11]利用低场核磁共振技术测定和面过程中及冻藏过程中面团的水分结合状态及分布情况,发现水分主要以弱结合水的形式存在,当和面时间为5 min时,弱结合水发生的迁移量最大,冷冻面团的冰晶孔洞面积较小且数量较少。王世新等[9]研究发现,随着加水量的增加,与未冷冻处理的面团相比,冷冻面团的黏性增大,面筋蛋白二级结构的β-折叠和α-螺旋比例增加。杨勇等[12]研究发现,到达冻结终点所需的时间越久,冷冻面团网络的孔隙越大,水分的迁移量越多,质构特性及流变学特性越差。面团中水分的动态变化使水分趋于均匀分布,而冻结过程中水分逐渐变成冰晶,面团的水分分布、冰晶形态逐渐改变,进而导致水分均匀度及面筋蛋白网络结构改变,但相关的机理研究鲜有报道。

基于此,本文拟在前期原位表征分析面团冷冻过程中面筋蛋白分子结构与水分分布的基础上[13],研究不同加水量面团冻结过程中的冻结曲线、水分均匀度变化,分析冰晶生长对面筋蛋白网络结构及维持其结构稳定性的化学作用力的影响,以期为面团冷冻技术的完善及最终产品品质的提高提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料

金苑精制粉(淀粉、蛋白质、脂肪和水的含量分别为74.0%、11.0%、2.1%和11.0%),河南金苑粮油有限公司;纯净水,郑州轻工业大学自制。

1.2 主要仪器与设备

JA20002型电子天平,上海良平仪器仪表有限公司;HA-3480A型全自动和面机,克莱美斯机电科技有限公司;NMI-20-060V-I型高性能变温核磁共振成像分析仪,上海纽迈电子科技有限公司;AT4508型多路温度测试仪,常州安柏精密仪器有限公司;JSM-6490LV型扫描电子显微镜,日本电子株式会社;LSM710型激光共聚焦扫描显微镜(SEM),德国蔡司公司。

1.3 实验方法

1.3.1 面团制备参考Y.L.Jiang等[8]的方法,并稍作修改。称取300 g金苑精制粉于全自动和面机中,分别加入质量分数为40%、45%、50%和55%的纯净水,于60 r/min条件下搅拌10 min,形成面团,再通过压面机压延5次,静置醒发60 min,使面团质地更均匀,备用。

1.3.2 冻结曲线测定将制备的面团用自封袋密封,于-20 ℃冰箱中冷冻,需提前调整好超低温冷冻储存箱的温度,并平衡24 h。使用多路温度测试仪记录面团中心温度的变化,每隔10 s记录一次面团中心温度,直至面团中心温度达到-18 ℃。

1.3.3 水分均匀度测定参考M.Li等[14]的方法,对面团进行低场核磁成像检测。图片像素点的标准差由下式计算得到:

1.3.4 冰晶形态测定将面团的SEM图加载到Matlab 2016a软件中,参考Z.L.Pan等[15]的程序方程,计算面团冰晶的平均孔隙面积、孔隙数量和孔隙率。

1.3.5 面筋蛋白网络结构定量分析参考Z.H.Huang等[16]的方法,切取2.5 cm×1.0 cm×1.0 cm的面团,不要用力挤压,避免对内部结构的破坏。将面团浸泡在体积分数为2.5%的戊二醛溶液中,固定12 h,切成10 mm厚的薄片,用质量浓度为0.25 g/L的罗丹明B对蛋白质避光染色5 min,用去离子水洗脱3 min后,将薄片置于激光共聚焦培养皿上,用激光共聚焦扫描显微镜进行观察,罗丹明B的激发波长为568 nm,发射波长为625 nm。

参考I.Lucas等[17-18]的方法,基于激光共聚焦扫描显微镜图像对面筋蛋白网络结构进行量化分析,使用Angio-Tool软件计算分支率和终点率。

1.3.6 化学作用力测定参考F.H.Cao等[19]的方法,并稍作修改。取1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm的面团,冷冻至不同温度(25 ℃、0 ℃、-3 ℃、-6 ℃、-9 ℃、-12 ℃、-15 ℃和-18 ℃)后,分别与5 mL 浓度为0.05 mol/L的NaCl溶液(SA)、浓度为0.6 mol/L的NaCl溶液(SB)、浓度为0.6 mol/L的NaCl溶液+浓度为1.5 mol/L的尿素溶液(SC)、浓度为0.6 mol/L的NaCl溶液+浓度为8 mol/L的尿素溶液(SD)和浓度为0.6 mol/L的NaCl溶液+浓度为8 mol/L的尿素溶液+浓度为50 mmol/L的DTT溶液(SE)混合,室温下振荡2 h,于10 000 r/min条件下离心20 min。取0.1 mL上清液,加入5 mL考马斯亮蓝G250,涡旋均匀后静置2 min,测定其吸光度OD595。以牛血清蛋白为参考,根据吸光度(y)和蛋白质含量(x)绘制标准曲线。离子键含量以溶解于SB与SA中的蛋白质含量之差表示;氢键含量以溶解于SC与SB中的蛋白质含量之差表示;疏水相互作用的贡献以溶解于SD与SC中的蛋白质含量之差表示;二硫键含量以溶解于SE与SD中的蛋白质含量之差表示[20]。

1.4 数据处理

使用Microsoft Excel 2010处理数据,利用Origin 2018软件作图,通过SPSS 23软件的Duncan多重比较法进行单因素方差分析,检验数据的显著性(P<0.05,差异显著)。每个实验均重复3次,实验数据以(平均值±标准差)表示。

2 结果与分析

2.1 冻结过程中面团的冻结曲线分析

根据温度变化,面团的冻结过程可分为3个阶段:第1阶段从面团初始温度降温至冷凝点0 ℃;第2阶段从0 ℃降温至-5 ℃,也称最大冰晶生成带;第3阶段从-5 ℃降温至冻结终点-18 ℃,也称深冻阶段[21]。加水量对面团冻结曲线的影响如图1所示。由图1可知,第1阶段温度降低较快,曲线斜率较大;第2阶段曲线相对平直,大量水分在此阶段转变为冰晶,释放出潜热,温度下降较慢,80%以上的水分被冻结;第3阶段面团内部剩余的水分逐渐冻结成冰晶。面团总冷冻时间和通过最大冰晶生成带的时间越短,面团内部大冰晶的比例越低,冷冻对面团的影响越小,更利于保护面团品质[12]。随着加水量的增加,面团中心温度达到-18 ℃所需时间呈先短后长的趋势,当加水量为45%时,面团中心温度达到-18 ℃所需时间最短(为38 min),这可能是因为50%和55%加水量的面团内部水分均较多,在冻结过程中释放的潜热也较多。而45%加水量面团比40%加水量面团内部水分分布更均匀且拥有更多晶核,生成的冰晶更小,冻结速率更快。因此,当加水量为45%时,经冷冻处理后的面团其品质优于其他加水量。

图1 加水量对面团冻结曲线的影响Fig.1 Effect of water addition on the dough freezing curve

2.2 冻结过程中面团水分均匀度分析

水分均匀度是对低场核磁成像的图像进行标准差计算得到的。图像的标准差可衡量图像中像素点像素值与均值之间的离散程度,间接反映面团中水分的分布情况,标准差越小,离散程度越小,表明面团中的水分越均匀,反之,越不均匀[22]。冻结过程中,随着温度的下降,面团内部水分逐渐转变为冰晶,氢质子信号强度随之下降直至检测不到。水分均匀度可量化这一过程,且水分均匀度变化越大,冰晶生长越快。面团冻结过程中水分均匀度的变化见表1。由表1可知,随着温度的降低,不同加水量面团的水分均匀度整体呈下降趋势。在-3 ℃降温至-6 ℃阶段,40%、50%和55%加水量面团的水分均匀度分别下降33.48、47.01和46.29后趋于稳定,这可能是因为0 ℃降温至-5 ℃阶段属于最大冰晶生成带,在此区间内,绝大多数水分由液态变为固态,冰晶急剧生长,面筋蛋白网络结构被破坏,导致冷冻面团品质变差。而45%加水量面团在-3 ℃降温至-6 ℃阶段的水分均匀度下降27.42,在-6 ℃降温至-9 ℃阶段下降11.37,表明在冻结过程中,45%加水量面团的冰晶生长较温和,减缓了冰晶对面筋蛋白网络结构的破坏,有利于提升冷冻面团的品质。在冻结终点(-18 ℃),水分均匀度随着加水量的增加先减小后增大,在加水量为45%时达到最小值,表明45%加水量面团在冻结终点的水分分布和冰晶分布较为均匀,对面团品质的影响较小[23]。结合冻结曲线,选择加水量为45%的面团进一步研究冻结过程中面筋蛋白网络微观结构及化学作用力的变化。

表1 冻结过程中面团水分均匀度的变化Table 1 Changes in moisture uniformity indicators during dough freezing process

2.3 冻结过程中冰晶形态变化分析

使用Matlab 2016a软件对面团的SEM图进行冰晶孔隙分析,并进一步量化面团中冰晶孔隙的分布和大小。冻结过程中面团冰晶孔隙如图2所示,其中白色区域是面团内部的冰晶和可冻结水,黑色区域是面团的背景[24]。由图2可知,从25 ℃降温至0 ℃阶段,面团内部水分分布较均匀;从0 ℃降温至-6 ℃阶段,水分转变为冰晶且孔隙面积逐渐变大、数量减少较快,这可能是因为该阶段属于最大冰晶生成带,大量水分聚集转化为冰晶且体积增大;从-6 ℃降温至-9 ℃阶段,冰晶大量生成,冰晶孔隙面积快速增大,这与该阶段水分均匀度快速减小相对应;从-9 ℃降温至-18 ℃阶段,冰晶重结晶且颗粒不断变大,破坏面筋蛋白网络结构,导致更大的孔隙形成。冻结过程中产生的大冰晶会对面筋蛋白网络结构造成机械损伤,使面团持气性减弱,导致面团解冻后的加工性能变差[25]。

图2 冻结过程中面团冰晶孔隙图Fig.2 The void map of the ice crystals during dough freezing process

冻结过程中面团冰晶孔隙参数的变化见表2。由表2可知,随着温度的降低,孔隙数量不断减少,平均孔隙面积不断增大且在-6 ℃降温至-9 ℃阶段快速增大,表明该温度范围内冰晶快速生成。温度继续降低,小冰晶逐渐聚集生长为大冰晶,进一步破坏面团面筋蛋白网络结构。

表2 冻结过程中面团冰晶孔隙参数的变化Table 2 Changes in the pore parameters of the ice crystals during dough freezing process

2.4 冻结过程中面筋蛋白网络微观结构定量分析

冻结过程中面筋蛋白微观结构如图3所示,其中,罗丹明B标记的面筋蛋白显示为红色,黑洞代表面筋蛋白网络结构中的孔隙或淀粉颗粒。由图3可知,在室温(25 ℃)下,面团中的面筋蛋白网络结构是完整和连续的,淀粉颗粒填充于面筋蛋白网络结构中且二者交联紧密。随着温度的降低,面筋蛋白网络结构逐渐松散,面筋蛋白被冰晶挤压聚集成块状,与淀粉颗粒间的相互作用降低。

图3 冻结过程中面筋蛋白网络微观结构Fig.3 Microstructure of gluten protein network during dough freezing process

面筋蛋白网络结构参数分支率和终点率可反映面筋蛋白的凝聚力,其中,分支率与面筋蛋白网络分布的均匀性密切相关,分支率越大,面筋蛋白网络分布越均匀;终点率可用来表征面筋蛋白的连续性,终点率越小,面筋蛋白的连续性越好[18]。冻结过程中面筋蛋白网络结构参数分支率和终点率的变化见表3。由表3可知,随着温度的降低,分支率从2.20×10-3逐渐降低至1.90×10-3,终点率从2.10×10-3逐渐升高至2.40×10-3,说明冰晶增大导致面筋蛋白网络结构被破坏,分布不均匀,面团品质随之下降。

表3 面团冻结过程中面筋蛋白网络结构参数分支率和终点率的变化Table 3 Changes in branch rate and endpoint rate of gluten protein network structure during dough freezing process

2.5 冻结过程中面筋蛋白化学作用力变化分析

化学作用力对面筋蛋白网络结构的稳定性具有重要作用[25],其中,由氨基和羧基的带电基团形成的离子键对维持面筋蛋白三级结构的稳定性具有重要作用;形成于水分子之间、蛋白质表面基团与结合水之间的氢键对维持面筋蛋白二级结构的稳定性具有重要作用;疏水相互作用会随着面筋蛋白中非极性氨基酸侧链微环境的变化而变化,疏水基团暴露越多,疏水作用越强;二硫键是维持面筋蛋白三级结构稳定性的重要作用力,同时也是促进面筋蛋白网络形成的重要化学键[26]。面团冻结过程中面筋蛋白化学作用力的变化如图4所示,其中不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)。由图4可知,随着温度的降低,氢键逐渐减少。冰晶的生长会减弱水分子之间、蛋白质表面基团与结合水之间的氢键作用,破坏面筋蛋白二级结构,并使二级结构向无序化转变[13]。随着冰晶的形成,面筋蛋白网络的交联被破坏,二硫键逐渐减少,另外,面筋蛋白三级结构逐渐舒展开,羧基与氨基间的离子键及巯基间的二硫键维持面筋蛋白三级结构的作用力也随之下降,蛋白质内部的疏水性基团被更紧密地包裹,最终导致疏水相互作用减弱。而疏水相互作用在-12 ℃的突然升高,可能是因为冰晶已形成较大颗粒,对蛋白质结构破坏程度较大,使得蛋白质中疏水性基团暴露,增大了疏水相互作用,而冰晶随着温度降低进一步变大,继续挤压蛋白质,其疏水相互作用持续降低[27]。

图4 面团冻结过程中面筋蛋白化学作用力的变化Fig.4 Changes in the chemical force of gluten proteins during dough freezing process

3 结论

本文研究了冻结过程中不同加水量面团的冻结曲线、水分均匀度、面筋蛋白网络微观结构及维持其结构稳定性的化学作用力,得到如下结论:随着冻结温度的降低,不同加水量面团的水分均匀度逐渐下降,冰晶逐渐变大且对面团的破坏不断增大,面筋蛋白网络间的相互作用力逐渐减弱,加水量为45%的面团达到冻结终点的时间最短,经过最大冰晶生成带的速率最快,水分均匀度下降最迅速,对面筋蛋白网络结构的破坏最小。随着冻结温度的降低,45%加水量面团的冰晶平均孔隙面积逐渐变大,孔隙数量逐渐变少,冰晶膨胀破坏了面筋蛋白网络结构的完整性,进一步减弱了维持蛋白高级构象的各种化学键。下一步将对面筋蛋白的理化特性及结构性质进行表征,以深入研究冷冻过程中面筋蛋白的分子性质及结构变化。