基于OMWTTFA的豇豆多农药残留非靶向检测方法研究

李跑,苏光林,黎才婷,杨清华

1.湖南农业大学 食品科学技术学院,湖南 长沙 410128;2.湖南省农业科学院湖南省农产品加工研究所,湖南 长沙 410125;3.中国检验认证集团湖南有限公司,湖南 长沙 410021

0 引言

豇豆(Vignaunguiculata)是我国较常见的豆类蔬菜之一,富含多种植物蛋白及维生素,深受消费者喜爱[1-2]。豇豆是一季多茬、花果同期的农作物,种植者为提高产量、控制病虫害发生,常在采收期施用农药,导致豇豆中农药残留问题较为突出[3-4]。多农药混合或过量使用、违禁农药使用等使得豇豆中多农药残留非靶向检测的难度不断增大[5-6]。现阶段,果蔬中多农药残留非靶向检测手段主要为气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术、液相色谱-质谱(LC-MS)联用技术等。其中,GC-MS联用技术是豇豆中多农药残留检测较常用的方法之一[7-9],但由于豇豆的基质效应、多农药复合施用等因素,GC-MS检测信号中常存在农药组分谱峰重叠、基线波动等干扰问题。此外,该方法常需结合农药标准品才能实现准确定性分析,较难实现多农药残留的快速非靶向检测[10-11]。

化学计量学方法可以有效消除GC和MS信号的基线波动并实现复杂信号的解析,已较广泛地应用于食品中多农药残留非靶向检测,如目标波段熵最小化(Band Target Entropy Minimization, BTEM)算法[12]、目标因子分析(Target Factor Analysis, TFA)算法[13-14]、免疫算法(Immune Algorithm, IA)[15]等。然而,上述方法存在参数较多、计算时间较长等问题,仍难以实现食品中多农药残留的快速非靶向检测[16]。因此,开发快速及高通量的解析算法逐渐成为多农药残留非靶向检测的新趋势。李跑等[17]提出了一种可实现多农药残留非靶向检测的移动窗口目标转换因子分析(Moving Window Target Transfer Factor Analysis, MWTTFA)算法,该方法具有“移动窗口”和TFA的优点,可实现多农药残留GC-MS数据的快速解析,但在实际食品样品检测时存在假阳性的问题,误判率较高。鉴于此,本文拟提出一种可实现豇豆中多农药残留准确非靶向检测的优化移动窗口目标转换因子分析(Optimize Moving Window Target Transfer Factor Analysis, OMWTTFA)算法,基于500种常见农药MS数据库对豇豆的GC-MS数据进行高通量解析,并将其应用于实际豇豆样品的多农药残留检测,以期为果蔬中多农药残留非靶向检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

豇豆,湖南农业大学东之源超市;农药混合标准品Ⅰ(甲霜灵、戊唑醇、丁硫克百威、杀虫脒、烯酰吗啉和精甲霜灵溶于丙酮溶液,质量浓度为10 mg/L)、农药混合标准品Ⅱ(甲基对硫磷、敌敌畏、乐果和马拉硫磷溶于丙酮溶液,质量浓度为100 mg/L),坛墨质检科技股份有限公司;硫酸镁、柠檬酸钠、乙二胺-N-丙基硅烷化硅胶(PSA)、乙腈,均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器与设备

QP 2010 Ultra型GC-MS联用仪,日本岛津公司;DB-5 MS型色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),安捷伦科技有限公司;TG16 MW型台式高速离心机,湖南赫西仪器装备有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品制备豇豆样品制备:参考文献[18]的前处理方法,准确称取10 g豇豆样品(已置于室温环境12 h)、1 g柠檬酸钠、0.5 g柠檬酸氢二钠、4 g硫酸镁、1 g氯化钠和10 mL乙腈于离心管中,手动振荡1 min后,于4200 r/min条件下离心5 min;取上清液6 mL,加入含有0.9 g硫酸镁和0.15 g PSA的离心管中,涡流振荡1 min;待溶液澄清后,取上清液过微孔滤膜(有机相,0.22 μm)后用于上机检测。

豇豆加标样品制备:取上述处理后的豇豆样品上清液,加入6 种农药混合标准溶液混匀,制备农药质量浓度为4 mg/L的豇豆加标样品Ⅰ;另取一批次豇豆样品上清液,与4 种农药混合标准溶液混匀,制备农药质量浓度为10 mg/L的豇豆加标样品Ⅱ。

1.3.2 检测条件参考文献[18]方法的测试条件:载气为He(纯度≥99.999%),流速为1.0 mL/min;EI离子源电压为70 eV;进样口、离子源及传输线温度均为280 ℃;进样量为1 μL,采用不分流进样模式;洗脱升温程序为95 ℃保持1.5 min,然后以20 ℃/min的速率升温至190 ℃,再以5 ℃/min的速率升温至230 ℃,最后以25 ℃/min的速率升温至290 ℃,保持15 min。

1.3.3 计算步骤在MWTTFA算法基础上,本文建立了OMWTTFA算法,增加了自适应迭代重加权惩罚最小二乘(Adaptive Iterative Re-weighted Penalized Least Squares, airPLS)计算步骤[19],可扣除不规则基线,消除色谱信号中基线的波动干扰。计算步骤如下:

1)参照文献[20]中方法,通过NIST和SDBS数据库收集500种农药残留标准MS数据,创建农药残留非靶向筛查数据库。

2)采用airPLS 扣除豇豆GC-MS数据中的基线波动干扰,利用所建立的农药残留非靶向筛查数据库与OMWTTFA算法得到的MS进行匹配,如果匹配度小于匹配阈值(700‰),则判定该农药残留组分信息不存在于该GC-MS数据中,如果匹配度大于匹配阈值,则判定该农药残留组分信息可能存在于该数据中,进行下一步计算。

3)根据第二步的筛选结果,将大于700‰的匹配区域与总离子流色谱图的对应保留时间区域进行对比,若该保留时间区域内无明显色谱峰,则认为该农药残留组分信息不存在于该GC-MS数据中;若在该保留时间区域内存在明显色谱峰与之对应,则判定该农药残留组分存在于该GC-MS数据中。

4)如果相同保留时间区域存在多个对应的色谱峰,或同一组分被判定在不同保留时间区域内有多个对应的色谱峰,则需要把匹配度值最大的MS与农药残留非靶向筛查数据库中的MS进行比对,如果两者相似,则判定该农药残留组分存在于该GC-MS数据中。

1.4 数据处理

在个人PC机上采用matlabR2020a软件实现OMWTTFA算法的程序化。将GC-MS数据转换为cdf格式数据,代入OMWTTFA程序进行计算,以实现豇豆中多农药残留非靶向检测。

2 结果与讨论

2.1 豇豆样品总离子流图分析

图1为豇豆和加标样品总离子流图。由图1可知,所有组分谱峰出现在30.00 min保留时间内。3组样品的原始总离子流图信号中均存在基线波动,在4.00～8.00 min和14.00～20.00 min处较明显;由OMWTTFA算法处理后的总离子流图的基线基本与0坐标轴重合,基线波动得到有效消除,色谱峰更加清晰;豇豆样品中待测组分主要分布在10.00～25.00 min保留时间区域,而豇豆加标样品Ⅰ中待测组分主要分布在5.00～25.00 min保留时间区域,豇豆加标样品Ⅱ中待测组分主要分布在10.00～20.00 min保留时间区域。然而,由于豇豆样品成分复杂,其总离子流图中谱峰繁多,信号较复杂,如果缺少农药标准样品,将较难快速找到未知农药残留所对应的色谱峰,进而难以实现样品中农药残留的非靶向检测。

图1 豇豆和加标样品总离子流图Fig.1 Total ion chromatograms of cowpea and spiked samples

2.2 基于OMWTTFA算法的非靶向检测结果

2.2.1 豇豆样品中农药残留非靶向检测结果经OMWTTFA算法第二步计算后,豇豆样品中存在13 种组分的匹配度阈值超过了700‰。然而,经第三步和第四步计算后,仅(Z)-8-十二烯基乙酸酯符合筛选要求。图2为豇豆样品中(Z)-8-十二烯基乙酸酯匹配度曲线及其MS图。由图2a)可知,(Z)-8-十二烯基乙酸酯有明显超过阈值700‰的匹配区域;由图2b)可知,在总离子流图所对应的保留时间13.95～14.11 min区域存在明显的色谱峰,可判断该组分信息可能存在于豇豆样品GC-MS数据中;由图2c)—d)可知,(Z)-8-十二烯基乙酸酯的标准质谱信息与实验质谱信息具有较高的相似性,故判定(Z)-8-十二烯基乙酸酯存在于豇豆样品中。(Z)-8-十二烯基乙酸酯又称梨小食心虫信息素,为昆虫自身分泌的微量化学物质,但在豇豆样品中未检出该农药残留。

图2 豇豆样品中 (Z)-8-十二烯基乙酸酯匹配度曲线及其MS图Fig.2 Matching curves and mass spectra of (Z)-8-dodecenyl acetate in cowpea samples

2.2.2 豇豆加标样品Ⅰ中农药残留非靶向检测结果利用豇豆加标样品Ⅰ对OMWTTFA算法的可行性进行验证,发现经过OMWTTFA算法第二步计算,豇豆加标样品Ⅰ中有21 种组分的匹配度阈值超过了700‰。根据OMWTTFA算法第三和第四步筛选后,豇豆加标样品Ⅰ中 6 种农药组分均成功检出。图3为豇豆加标样品Ⅰ中甲霜灵匹配度曲线及其MS图。由图3a)—b)可知,甲霜灵的匹配度曲线在保留时间11.25～11.35 min区域存在对应的色谱峰;由图3c)—d)可知,在保留时间11.25～11.35 min区域的实验MS图与标准MS图基本一致,故豇豆加标样品Ⅰ中检测出甲霜灵。

图3 豇豆加标样品Ⅰ中甲霜灵匹配度曲线及其MS图Fig.3 Matching curves and mass spectra of metalaxyl in cowpea spiked sampleⅠ

2.2.3 豇豆加标样品Ⅱ中农药残留非靶向检测结果利用豇豆加标样品Ⅱ进一步验证OMWTTFA算法对其他农药的适用性,经OMWTTFA算法第二步计算,豇豆加标样品Ⅱ中有21 种组分的匹配度阈值超过了700‰。图4为豇豆加标样品Ⅱ中二溴磷、敌敌畏匹配度曲线及其MS图。根据OMWTTFA算法第三步并结合图4a)—c)可知,二溴磷与敌敌畏在保留时间4.87～4.96 min区域对应同一色谱峰,将二溴磷、敌敌畏的标准MS图分别与保留时间4.87～4.96 min区域实验MS图对比,结果见图4d)—f)。由图4d)—f)可知,二溴磷的标准MS图与实验MS图不一致,可判定豇豆加标样品Ⅱ中不存在二溴磷;而敌敌畏的标准MS图与实验MS图基本一致,故判定豇豆加标样品Ⅱ中存在敌敌畏。此外,经OMWTTFA算法计算步骤筛选后,其余3种有机磷农药均被检出。由此可知,OMWTTFA算法可实现多种有机磷农药的非靶向检测。

图4 豇豆加标样品Ⅱ中二溴磷、敌敌畏匹配度曲线及其MS图Fig.4 Matching curves and mass spectra of 2-dichloroethyl dimethyl phosphate and dichlorvos in cowpea spiked sampleⅡ

2.3 OMWTTFA算法与MWTTFA算法检测对比结果

表1为 豇豆样品经OMWTTFA算法与MWTTFA算法的解析结果。由表1可知,在两种算法解析下,检出组分的匹配度均超过800‰。经MWTTFA算法解析,豇豆样品中(Z)-8-十二烯基乙酸酯仍作为农药残留中间物被检出,豇豆加标样品Ⅱ中检出4 种加标组分;相较OMWTTFA算法,豇豆加标样品Ⅰ中仅检出5 种加标组分,未检出萎锈灵。以上结果表明,OMWTTFA算法可增加airPLS计算步骤,扣除不规则基线,消除色谱信号中基线的波动干扰,因此其检测准确性优于MWTTFA算法,可实现豇豆中多农药残留的准确非靶向检测。

表1 豇豆样品经OMWTTFA算法与MWTTFA算法的解析结果Table 1 Analysis results of cowpea samples by OMWTTFA and MWTTFA algorithm

3 结论

本文提出了OMWTTFA算法,建立了500 种农药标准MS数据库,结合GC-MS建立了一种豇豆中多农药残留非靶向检测新方法,并对豇豆样品及加标样品进行了检测。结果表明,该方法可在30.00 min保留时间内实现所有农药的非靶向检测,实际豇豆样品中未检出农药,而两组加标样品中所有农药均被检出;能有效消除基线波动的干扰,实现豇豆样品及豇豆加标样品中多农药组分的准确非靶向检测,且准确性优于MWTTFA算法,有望为豇豆及其他果蔬中多农药残留检测提供一种新途径。但该方法目前尚未实现复杂食品基质效应的消除,且依旧较难实现同分异构体农药残留的准确检测,还需作进一步研究。此外,还应采用更多果蔬样品对该方法进行验证,从而为果蔬中多农药残留非靶向检测技术的开发提供指导。