抗猪肠道冠状病毒生物活性化合物的研究

文│童秋廷（山东省博兴县湖滨镇畜牧兽医站）

在生猪养殖中，各种肠道疾病频繁发生，严重影响了生猪生产性能，给养猪业带来了巨大的经济损失。猪肠道冠状病毒是引起猪腹泻的常见病原体，传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒均属于冠状病毒科α冠状病毒属。传染性胃肠炎病毒最早于1946年在美国被发现，尽管该病毒在养猪场的发病率不高，但新生仔猪感染后的死亡率几乎达到100%。猪流行性腹泻于1971年在英国首次被确诊，其病原体猪流行性腹泻病毒于1978年被确定为一种新型冠状病毒，猪流行性腹泻的患病率据报道为50.21%～62.1%，新生仔猪感染猪流行性腹泻病毒后死亡率高达100%。猪德尔塔冠状病毒又被称为猪丁型冠状病毒，属于δ冠状病毒属，分子监测中首次于2012年在猪直肠拭子中检测到，2014年美国首次报告了猪德尔塔冠状病毒引起的腹泻。猪德尔塔冠状病毒腹泻的患病率低于猪流行性腹泻，但高于传染性胃肠炎病毒腹泻，导致新生仔猪的死亡率低于两者。猪急性腹泻综合征冠状病毒（SADS-CoV）也被称为猪肠道α冠状病毒（Swine enteric alphacoronavirus，SeACoV）和猪肠道α病毒（Porcine enteric alphacoronavirus，PEAV），2017年在中国腹泻仔猪中首次发现。迄今为止，在临床样本中检测到猪急性腹泻综合征冠状病毒的报道并不多，仅在广东、福建、辽宁和甘肃省的腹泻样本中检测到。猪急性腹泻综合征冠状病毒感染导致5日龄以下的仔猪高达90%的死亡率，8日龄以上仔猪的死亡率降低至5%。目前，缺乏用于预防和治疗猪肠道冠状病毒的药物，因此有必要总结已发现的对这些冠状病毒具有抑制作用的生物活性化合物及其抑制机制，为药物研发提供依据。由于病毒的有效复制取决于宿主细胞，总结影响这些冠状病毒复制的宿主因素有助于识别新的抗病毒靶点。

一、猪肠道冠状病毒复制的重要宿主因素

抗病毒试剂的作用机制一般分为两类，一类针对病毒本身，另一类针对参与病毒生命周期的重要宿主因素。

1.细胞凋亡。一些病毒逃避细胞凋亡以获得足够的时间产生子代病毒，而一些病毒主动诱导细胞凋亡以促进子代病毒的释放和传播。多项研究表明，细胞凋亡有利于猪流行性腹泻病毒、猪德尔塔冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒的复制。猪流行性腹泻病毒通过激活线粒体凋亡诱导因子触发细胞凋亡。猪德尔塔冠状病毒通过触发线粒体细胞色素c向细胞质中的释放而引起细胞凋亡。猪急性腹泻综合征冠状病毒同时诱导外源性细胞凋亡和内源性细胞凋亡。传染性胃肠炎病毒诱导细胞凋亡的途径包括胱天蛋白酶依赖性的外源性途径、内源性途径以及凋亡诱导因子介导的胱天蛋白酶非依赖性途径，但阻断胱天蛋白酶对传染性胃肠炎病毒的复制没有明显的影响。

2.自噬。真核细胞自噬对不同的病毒表现出不同的作用。有研究认为，自噬对传染性胃肠炎病毒的复制具有负调控作用，但另一项研究指出，自噬可促进传染性胃肠炎病毒的感染和复制。猪流行性腹泻病毒诱导的自噬有利于病毒复制，PEDV ORF3蛋白是一种依赖于内质网应激反应的自噬诱导剂，PEDV ORF3蛋白能刺激内质网应激反应，而内质网应激反应抑制剂4-苯基丁酸的敲除促进了猪流行性腹泻病毒的复制。猪德尔塔冠状病毒、猪急性腹泻综合征冠状病毒与自噬之间的相互作用仍有待研究。

3 . 丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路。MAPK信号通路是哺乳动物细胞中普遍存在的信号转导通路，由多种病毒操纵。细胞外信号调节激酶（ERK）、Janus激酶（JNK）和p38 MAPK是3种主要的MAPK途径，已被证明主要在猪流行性腹泻病毒和猪德尔塔冠状病毒进入后发挥作用，如参与病毒生物合成和子代释放。有研究表明，p38抑制剂或p38的敲除抑制了传染性胃肠炎病毒的繁殖，表明p38对传染性胃肠炎病毒的复制是必要的。而猪急性腹泻综合征冠状病毒的有效传播需要ERK的激活。

4.胆固醇。胆固醇影响病毒生命周期的多个阶段，尤其是进入过程。病毒胆固醇和细胞胆固醇都参与传染性胃肠炎病毒和猪德尔塔冠状病毒的复制，而猪流行性腹泻病毒需要细胞胆固醇才能有效复制。病毒胆固醇的耗竭并不影响传染性胃肠炎病毒与其受体氨基肽酶N的结合，而是影响吸附后的步骤。猪流行性腹泻病毒的附着和内化需要细胞胆固醇，细胞胆固醇和病毒胆固醇对猪德尔塔冠状病毒的附着和内化都至关重要。

5.其他宿主因素。表皮生长因子受体属于受体酪氨酸激酶家族，在许多细胞中广泛表达，在传染性胃肠炎病毒的附着和进入发挥着至关重要的作用，表皮生长因子受体的激活也有助于猪流行性腹泻病毒的复制，但其在猪流行性腹泻病毒生命周期中的作用仍有待研究。

功能性细胞受体，如受体氨基肽酶N是传染性胃肠炎病毒的功能性细胞受体，转铁蛋白受体1据推测可能是猪流行性腹泻病毒的功能性细胞受体。

跨膜蛋白41B支持传染性胃肠炎病毒复制所必需的双膜小泡的形成，并参与传染性胃肠炎病毒内化和早期复制。跨膜蛋白酶丝氨酸2和镶嵌丝氨酸蛋白酶在猪流行性腹泻病毒感染期间具有促进PEDV S蛋白切割、促进细胞-细胞融合和病毒-细胞融合的特性。锌指DHHC型棕榈酰转移酶17直接影响猪德尔塔冠状病毒的复制。

二、抗猪肠道冠状病毒的生物活性化合物

在目前报道的对猪肠道冠状病毒具有抗病毒活性的生物活性化合物中，一些化合物对传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪德尔塔冠状病毒中的两种或三种表现出抑制作用，如从中药隐孔菌（Cryptoporus volvatus，一种木生真菌）中提取的过氧化麦角甾醇、25-羟基胆固醇和褪黑素。关于抑制猪急性腹泻综合征冠状病毒的生物活性化合物的报道相对有限。对其他冠状病毒具有高度抑制作用的药物是有价值的参考，应该更多地关注对多种冠状病毒有效的药物。

姜黄素是姜黄的主要多酚类化合物，对传染性胃肠炎病毒的早期感染有抑制作用，尤其是对病毒吸附有抑制作用，对传染性胃肠炎病毒也有直接的杀毒作用。金丝桃素是从圣约翰草（Hypericum perforatum L.）中提取的一种具有生物活性的二胺基化合物，可以抑制传染性胃肠炎病毒的复制。儿茶素源自绿茶，具有抗传染性胃肠炎病毒的特性，这与其抗氧化有关。何首乌多糖可抑制传染性胃肠炎病毒的复制，减轻活性氧产生和细胞凋亡。Tyrphostin A9是tyrphotin类受体酪氨酸激酶抑制剂，可以通过减轻p38的激活来发挥抗传染性胃肠炎病毒作用，主要作用于吸附后阶段。褪黑素和结构类似物（包括吲哚、色胺和l-色氨酸）能够干扰传染性胃肠炎病毒的进入。番茄碱和25-羟基胆固醇也能抑制传染性胃肠炎病毒的复制，但作用机制尚不清楚，它们对猪流行性腹泻病毒也具有抗病毒活性，它们对这两种病毒的抑制机制可能相似。

番茄碱是一种从番茄表皮和叶片中提取的甾体生物碱，对猪流行性腹泻病毒复制有良好的抑制作用。槲皮素是一种类黄酮分子，靶向影响猪流行性腹泻病毒感染的初始阶段。甘草酸是甘草根提取物的主要成分，主要干预猪流行性腹泻病毒的进入和复制。芦荟提取物在猪流行性腹泻病毒生命周期后期具有抑制作用，也可以在不影响病毒基因组和PEDV S1蛋白的情况下直接灭活病毒粒子。儿茶素-没食子酸酯是绿茶中的主要多酚，在猪流行性腹泻病毒生命周期的多个阶段发挥作用，包括附着、进入、复制和组装。银杏叶外果皮多糖可通过抑制病毒的附着和进入，有效缓解猪流行性腹泻病毒诱导的细胞病变。过氧化麦角甾醇限制猪流行性腹泻病毒的内化、复制和释放，还具有灭活猪流行性腹泻病毒粒子和减轻猪流行性腹泻病毒诱导的细胞凋亡的能力。金丝桃素、苦楝原花青素、苦楝皮、黄连、黄柏皮和苦参提取物、tyrphostin A9和褪黑素均对猪流行性腹泻病毒有抑制作用。

过氧化麦角甾醇阻断猪德尔塔冠状病毒附着和进入，并在病毒进入后的早期和中期起作用。此外，它还能直接灭活猪德尔塔冠状病毒的传染性，缓解细胞凋亡，其抗病毒活性与其减轻猪德尔塔冠状病毒诱导的p38激活有关。胆汁酸如鹅去氧胆酸（chenodeoxycholic acid）和石胆酸扰乱了猪德尔塔冠状病毒的进入后阶段，但鹅去氧胆酸已被证明可以促进猪流行性腹泻病毒的复制。25-羟基胆固醇作用于猪德尔塔冠状病毒的进入。25-羟基胆固醇对传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒也有抑制作用，25-羟基胆固醇具有开发成为广谱抗冠状病毒药物的潜力。