晋产毛建草茶中有效成分鉴别及抗氧化活性研究

荆文静，任 蕾

（1.山西工程职业学院，山西 太原 030001；2.山西中医药大学，山西 太原 030002）

毛建草[1]，学名岩青兰，唇形科植物，生长于海拔650～2 400 m 的高山草原、草坡下阳处。全草具香气，有药用价值，具有清热、解表、止痛的功效。山西晋北地区百姓自古将其制为茶饮，百姓俗称“毛尖茶”。毛建草茶由毛建草发酵制成，具有延缓衰老、清热排污的保健作用，该草本植物中含有丰富的氨基酸、维生素和微量元素，对于改善心肌缺血、缓解心绞痛、预防心血管疾病降低血黏度和血小板聚集度以及降低胆固醇的含量都具有一定的疗效[1]。

中国是世界茶叶的故乡也是世界唯一具有六大茶类的国家[2]。茶叶中含有多种具有生物活性的物质，如茶多酚、咖啡因和氨基酸等[3]。茶多酚和咖啡因在茶叶中含量的多少常被作为检测茶叶品质的一项重要指标。大量研究表明，茶多酚对人体健康极为有利[4-8]。茶多酚具有降压安神、降血脂和延缓衰老的作用。适度的食用咖啡因可以兴奋神经，促进新陈代谢，使人头脑清醒有助于思维，提高工作效率，同时咖啡因耗能增强人体心脏和胃肠道的功能、调节脂肪代谢，还能起到解毒的作用[9-16]。因此从茶叶中如何提出更纯的茶多酚和咖啡因尤为重要，本实验对茶多酚、咖啡因的初提最优溶剂进行筛选并利用标准品和紫外分光光度法分析出茶多酚和咖啡碱存在于萃取部的位置，从而为毛建草茶中的茶多酚和咖啡碱的提取、纯化奠定基础。

1 实验材料

1.1 药材和试剂

茶多酚标准品，T0202-20MG，上海伊卡生物技术有限公司；咖啡因标准品，AS1055，上海伊卡生物技术有限公司；毛尖王茶，静乐县巾字土特产有限责任公司；石油醚，AR，天津市天力化学试剂有限公司，批号：20 160308；氯仿，AR；乙酸乙酯，AR，天津市兴复科技发展有限公司，批号：20 150624；正丁醇，AR，天津市兴复科技发展有限公司，批号：20 151031；浓盐酸，AR；无水乙醇，AR，天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20 151017；氨水，AR，天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20 140310；氯化铁，天津市兴复科技发展有限公司，批号：20 160304；三吡啶三吖嗪，上海伊卡生物技术有限公司，T0235-1G；醋酸铵；硫酸亚铁，天津市兴复科技发展有限公司，批号：20140816。

1.2 仪器

FA224 电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；TU-1810 紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；JA4003 粉碎机，40 目（0.425 mm）筛；HK-1D 恒温水浴槽，南京大学应用物理研究所监制；旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；pH 调节计；1 000 mL分液漏斗；实验室常见仪器。

2 实验方法

2.1 实验原理

将毛建草茶经过热水回流提取后，分别用不同极性的溶剂萃取，利用铁离子还原/氧化分析（FRAP），得出各个溶剂部分的抗氧化能力；并将萃取后的供试品利用紫外分光光度法，对照茶多酚标准品、咖啡碱标准品进行定性分析。

铁离子还原/氧化能力法[17-18]（FRAP）测定总抗氧化能力的原理是酸性条件下抗氧化物可以还原Fe-TPTZ 产生蓝紫色的Fe-TPTZ，然后在593 nm 处测定该处的吸光度，则此吸光度可作为样品中的总抗氧化能力的指标。由于样品中的铁离子或亚铁离子的总浓度通常低于10 μmol/L，因此样品中的铁离子或亚铁离子不会显著干扰FRAP 法的检测反应。由于反应体系中的铁离子或亚铁离子是和TPTZ 螯合的，样品本身含有的少量金属离子螯合剂通常也不会显著影响检测反应。

定性分析是指根据紫外色谱中样品的吸收光谱的形状和位置与标准品的基本相似以及在薄层色谱中斑点出现位置相近，则可初步判断样品中含有与标准品相同的成分。

2.2 试剂的准备

2.2.1 茶多酚标准品的配制

精密称取茶多酚标准品5 mg，溶于50 mL 容量瓶中，用50%的乙醇稀释至刻度线，摇匀，配制成100 mg/L的标准原液，备用。

2.2.2 咖啡因标准品的配制

精密称取咖啡碱标准品5 mg，溶于50 mL 容量瓶中，用50%的乙醇稀释至刻度线，摇匀，配制成100 mg/L的标准原液，备用。

2.2.3 醋酸铵缓冲液的配制（0.3 mol/L）

取醋酸铵25 g 加水25 mL 溶解后，加7 mol/L 盐酸溶液38 mL，用2 mol/L 盐酸溶液或5 mol/L 氨溶液准确调节pH 至3.5，用水稀释至100 mL，备用。

2.2.4 TPTZ 的配制（0.01 mol/L）

取浓盐酸1 mL 加水至300 mL，制成400 mmol/L的盐酸备用。取TPTZ 31.233 mg，用10 mmol/L 的盐酸定容至10 mL，备用。

2.2.5 三氯化铁溶液的配制（0.02 mol/L）

取0.270 29 g 三氯化铁定容至50 mL，备用。

2.2.6 展开剂配置

茶多酚展开剂：用移液管精密量取甲酸16 mL、乙酸乙酯16 mL、甲醇4 mL，按照4∶4∶1 的体积比配置得到茶多酚展开剂。

咖啡因展开剂：用移液管精密量取氯仿27 mL、甲醇3 mL，按照9∶1 的体积比配置得到咖啡因展开剂。

2.3 毛建草茶水提物的制备

称取50 g 毛尖王茶，用粉碎机粉碎，过40 目（0.425 mm）筛，按照料液比1∶20，温度100 ℃加入蒸馏水1 000 mL，加热回流12 min，回流冷凝管第一滴滴下开始计时。然后用纱布趁热过滤。再用旋转蒸发仪进行提取物的浓缩，体积至200 mL 左右，将浓缩后的提取物定容至250 mL，备用。

2.4 不同极性溶剂提取物的制备[19]

将水提物先用等体积的石油醚萃取，上层为石油醚层。水层仍用等体积的石油醚萃取2 次，合并三次萃取的石油醚层，回收溶剂（60 ℃），将石油醚层蒸干，加入50%的乙醇50 mL 制得石油醚部；将下层水层用等体积的氯仿萃取，下层为氯仿层，同理再用等体积氯仿萃取2 次，合并3 次萃取的氯仿，回收溶剂（70 ℃），将氯仿层蒸干，加入50%的乙醇50 mL 制得氯仿部；将上层水层用等体积的乙酸乙酯萃取，上层为乙酸乙酯层。水层仍用等体积的乙酸乙酯萃取2次，合并3 次萃取的乙酸乙酯层，回收溶剂（80 ℃），将乙酸乙酯层蒸干，加入50%的乙醇50 mL 制得乙酸乙酯部；将下层水层用等体积的正丁醇萃取，上层为正丁醇层，使用等体积正丁醇萃取2 次，合并3 次萃取的正丁醇层，回收溶剂（60 ℃旋转蒸发仪），将正丁醇层蒸干，加入50%的乙醇50 mL 制得正丁醇部；将水层蒸干加入50%的乙醇50 mL 制得水部。分别将其分成等量的2 份，一份用于做有效成分鉴别，另一份用于做抗氧化性研究。实验流程如图1 所示。

图1 实验流程图

2.5 毛建草茶有效成分鉴别

用紫外分光光度法对所得5 种不同的萃取部以及茶多酚和咖啡因标准品进行检测，然后进行分析。

2.6 FeSO4 标准曲线的绘制

取0.1～1.6 mmol/L 浓度范围的FeSO4标准溶液于具塞试管中，准确加入6 mL FRAP 工作液[V（醋酸盐缓冲液）∶V（FeCl3溶液）∶V（TPTZ 溶液）=10∶1∶1]，600 μL 蒸馏水，混匀，在37 ℃下反应10 min，于593 nm 测定吸光度值，绘制标准曲线。

2.7 各极性溶剂提取物抗氧化能力检测

在具塞试管中分别加入200 μL 不同极性样品溶液，准确加入6 mLFRAP 工作液[V（醋酸盐缓冲液）∶V（FeCl3溶液）∶V（TPTZ 溶液）=10∶1∶1]，600 μL蒸馏水，混匀，37℃下恒温反应10 min，在593 nm 处测定吸光度值，平行测3 次，取其均值A。在标准曲线上换算成相应FeSO4的浓度，即为FRAP 值。

3 实验内容和结果

3.1 毛建草茶有效成分鉴别

3.1.1 各有机溶剂萃取部紫外色谱（图2～图6）

图2 乙酸乙酯部位紫外色谱

图4 水部位紫外色谱

图5 氯仿部位紫外色谱

图6 石油醚部位紫外色谱

3.1.2 茶多酚和咖啡因标准品紫外色谱（图7、图8）

图7 茶多酚标准品紫外色谱

图8 咖啡因标准品紫外色谱

3.1.3 薄层色谱（图9、图10）

图9 茶多酚标准品和乙酸乙酯部位薄层图

图10 咖啡因标准品和石油醚部位薄层图

3.1.4 紫外色谱和薄层色谱分析

对紫外色谱进行分析，茶多酚标准品在306 nm处出现波峰，咖啡因标准品在292 nm 处出现波峰。有机溶剂各萃取部位中，乙酸乙酯部位在305 nm 处出现波峰且与茶多酚标准品出现峰的波形相似，石油醚部位在292 nm 处出现波峰且与咖啡因标准品出现峰的波形相似，而且从薄层色谱分析茶多酚标准品的斑点在乙酸乙酯部位中也出现，同样咖啡因标准品的斑点在石油醚部位中也出现，则可判断乙酸乙酯部位中茶多酚含量多，石油醚部位中含有咖啡因含量多。因此在毛建草茶中用乙酸乙酯提取茶多酚最优，用石油醚提取咖啡因最优。

3.2 抗氧化性能力测试结果

3.2.1 标准曲线

图11 为FeSO4标准曲线，由图11 可知，FeSO4浓度在0.1～1.5 mmol/L 范围内与在593 nm 处的吸光度呈良好线性关系，回归方程为y=0.582 1x+0.005，R2=0.999 2。

图11 FeSO4 标准曲线

3.2.2 不同萃取部位抗氧化性能力比较

利用FRAP 法测定毛建草茶不同极性萃取液的抗氧化能力，结果如图12 所示，Fe3+还原抗氧化能力顺序为：乙酸乙酯部位（537.3）＞正丁醇部位（536.0）＞水部位（518.2）＞氯仿部位（221.1）＞石油醚部位（94.5）由此可见，毛尖王茶不同极性萃取液的抗氧化活性中，乙酸乙酯部位最强，石油醚部位最弱。

图12 不同萃取部位抗氧化能力比较

4 结论

利用紫外分光光度法分别对毛建草茶水提物的各有机溶剂萃取部进行色谱分析，可确定该茶饮中富含茶多酚及咖啡因；由紫外图谱和薄层分析可得出乙酸乙酯部位中茶多酚含量最多，石油醚部位中咖啡因含量最多。因此可推断在毛建草茶的提取工艺中，茶多酚的最佳提取剂为乙酸乙酯，咖啡因的最佳提取剂为石油醚。

利用铁离子还原/抗氧化能力分析（FRAP）法测定不同溶剂部位的铁离子还原能力，得出各个萃取部都具有一定的抗氧化能力，其顺序为乙酸乙酯部位＞正丁醇部位＞水部位＞氯仿部位＞石油醚部位，因此可判断毛建草茶具有一定的抗氧化活性，可为进一步开发利用这类民间代茶饮提供理论依据。