接骨木生物碱体外抗氧化性研究

康大伟，董赫男，高红梅，陈玉花

（1.内蒙古民族大学化学与材料学院，内蒙古通辽 028043；2.内蒙古自治区天然产物化学与功能分子合成重点实验室，内蒙古 通辽 028043；3.内蒙古民族大学 体育学院，内蒙古 通辽 028043）

接骨木（Sambucus Williamsii Hance）又名木蒴、续骨木、接骨草和九节风等，是一种常见中药和蒙药材，在欧洲接骨木常作药植栽种，其成分可抗氧化、提升人体免疫。作为中医的传统药材，接骨木被广泛应用于治疗骨折、跌打损伤等。接骨木喜阳又耐荫、耐寒且耐旱，根系十分发达，容易人工栽培，对气候条件要求不高，具有很强的适应性，在全世界范围内广泛分布，全年可采［1］。

羟基自由基（·OH）是一种生物体内存在的超高活性自由基，由一个氧原子和一个氢原子组成，是一种非常强的氧化剂，其氧化性比高锰酸钾等强氧化剂还强，在自然界中仅次于氟的氧化剂，具有非常高的反应活性。其能够破坏细胞与组织内的脂质、蛋白质、DNA等，与许多疾病及衰老现象密切相关。芬顿（Fenton）反应中发挥主要作用的是芬顿试剂，由过氧化氢和二价铁盐组成的具有强氧化性的体系。反应式为：

反应中邻二氮菲与二价铁离子生成红色配合物，随着提取液的加入，氧化作用也随之减弱，从而利用吸光度变化来监测对羟基自由基的消除情况［2］。

过氧化氢（hydrogen peroxide）化学式为H2O2，是一种超强氧化剂，极易溶于水。通过芬顿反应，可以很容易透过细胞膜与细胞内铁离子作用，生成活性极高的自由基。所以，近年来过氧化氢已成为研究细胞氧化损伤的重要材料。

基于接骨木长久以来的药用价值及抗氧化效果，利用实验方法探究了其生物碱成分的体外抗氧化性质。近年来，国内外也有一些评价中药材抗氧化能力的报道，例如槲皮素［5］、山茱萸多糖［6］、食用菇多糖［7］、青藤碱［8］、荠菜总黄酮［9］、山楂叶多糖［10］、香蕉皮黑色素［11］、西红花酸［12］和鸡骨柴黄酮［13］等。将该方法应用到接骨木生物碱提取液上，实验数据表明接骨木生物碱成分对羟基自由基、超氧阴离子自由基和过氧化氢具有良好的消除作用。

1 实验部分

1.1 主要仪器

紫外可见分光光度计UV5（瑞士梅特勒托利多）；SD 型超声波清洗器（深圳科力超声）；RE53AC型旋转蒸发仪（上海亚荣仪器厂）；DZKW-8-4型恒温水浴（北京医疗仪器厂）；XPR56/AC电子天平（瑞士梅特勒托利多）；奥豪斯酸度计（纳德科学仪器厂）。

1.2 原料与试剂

原料：盐酸小檗碱对照品（上海迈瑞尔生化科技有限公司）；接骨木（产地：内蒙古通辽市扎鲁特旗）。

试剂：Tris-三羟甲基氨基甲烷（Sigma-Aldrich）；过氧化氢、硫酸亚铁铵、邻二氮菲和邻苯三酚（北京化学试剂厂）。

1.3 标准曲线绘制及样品分析

准确称取10 mg盐酸小檗碱对照品，无水乙醇溶解并定容置于100 mL容量瓶，浓度为0.1 mg·mL-1。精确量取标准品溶液0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL，置于容积5 mL比色管中，无水乙醇稀释至刻度，空白对照选取无水乙醇，测定波长选择426 nm，测量吸光度数值。横坐标为浓度（mg·mL-1），纵坐标为吸光度（A），回归方程如下：

浓度范围为0.099～0.796 mg·mL-1，浓度与吸光度呈现的线性关系良好。

1.4 提取方法选择

粉碎接骨木15份，每份2.5 g，10份1组，提取溶剂选择100 mL盐酸-无水乙醇溶液（比例1∶100），通过回流、振荡和超声波方法进行提取，收集滤液用于测试使用。5 mL比色管内加入少量提取液，按照1.3方法测定提取液吸光度值（A）带入回归方程，通过计算得出接骨木生物碱类化合物的含量。

1.5 对羟自由基（·OH）清除作用

通过芬顿反应得到羟自由基，生成红色配合物后，再加入接骨木生物碱提取液，从而降低羟自由基对二价铁离子/邻二氮菲的氧化作用，利用吸光度数值变化来监测对羟自由基的消除情况。

0.2mL浓度7.5 mmol·L-1硫酸亚铁铵溶液，0.2 mL浓度7.5 mmol·L-1邻二氮菲溶液和准确量取1.0 mL、pH=7.47 Tris-HCl 缓冲溶液加入1 号比色管，重复上述步骤得到2 号和3 号比色管。1.0 mL 浓度7.5 mmol·L-1H2O2加入2、3号比色管，适量的接骨木生物碱的提取液加入3号比色管，用超纯水定容，置于37 ℃水浴1 h，冷却至室温，以超纯水为参比，在508 nm处测定吸光度，计算消除率P。

式中：A（样品）为加入提取液后的羟自由基体系的吸光度，即为1号比色管，A（未损）为未加入H2O2体系吸光度，即为2号比色管，A（损）为加入H2O2体系的吸光度，即为3号比色管。

1.6 对超氧阴离子自由基（）清除作用

具有很强的氧化能力的超氧阴离子自由基，可在生命代谢过程中产生，对其消除能力可作为衡量抗氧化物质活性的重要参数。

将3份4.4 mL、pH=8.3 Tris-HCl缓冲溶液分别加入3支10 mL比色管，30 ℃水浴恒温30 min，将适量生物碱的提取液加入4、5号比色管中，准确量取0.5 mL、浓度0.2 mmol·L-1邻苯三酚溶液加入5、6号比色管中。将3支比色管摇匀，30 ℃水浴中恒温5 min后取出，加入3滴8 mol·L-1HCl，摇匀。以超纯水为参比，在320 nm处测定吸光度，计算得出消除率（P）。

式中：A0为不加入提取液体系的吸光度，A1为加入提取液不加邻苯三酚溶液体系的吸光度，A2为加入提取液和邻苯三酚溶液体系的吸光度。

1.7 对过氧化氢（H2O2）的清除作用

将2份5 mL浓度为10 mmol·L-1过氧化氢-磷酸溶液（pH=7.4）分别加入7、8号比色管，将适量的接骨木生物碱的提取液分别加入8、9号比色管中，超纯水稀释1、3号比色管至刻度，摇匀。以超纯水为参比，在200 nm处测定吸光度，计算得出消除率P。

式中：A0为未加入提取液的过氧化氢溶液体系的吸光度，A1为加提取液和过氧化氢溶液体系的吸光度，A2为加入提取液的吸光度。

2 结果与分析

2.1 最佳条件的选择

在提取时间为20 min条件下，震荡、超声和回流等3种不同提取方法测得生物碱含量结果见表1。

表1 震荡、超声和回流等3种提取方法得到的提取量Tab.1 The extraction amount obtained by three extraction methods：oscillation，ultrasound and reflux

通过表1 得出超声波提取法优于回流提取法和室温震荡提取法。

2.2 对羟自由基的清除作用

基于1.5 实验方法得到的接骨木生物碱提取液消除羟自由基（·OH）效果见图1。由图1 得出结论，对于羟自由基接骨木生物碱提取液有较好的消除作用。浓度范围为0.026～0.039 mg·mL-1，消除作用与接骨木生物碱浓度展现良好的量效关系。

图1 对于羟自由基消除效果Fig.1 The effect diagram for hydroxyl radical elimination

图2 对超氧阴离子自由基消除效果Fig.2 The effect of eliminating superoxide anion radicals

2.3 对超氧阴离子清除作用

基于1.6实验方法，接骨木生物碱提取液对超氧阴离子自由基消除效果见图3。由图3得出结论，对于超氧阴离子自由基接骨木生物碱提取液有较好的消除作用。浓度范围为0.064～0.151 mg·mL-1，消除作用与接骨木生物碱浓度展现良好的量效关系。

图3 对过氧化氢消除效果Fig.3 The effect on hydrogen peroxide elimination

2.4 对过氧化氢清除作用

基于1.7实验方法，接骨木生物碱提取液对过氧化氢消除效果见图3。由图3得出结论，对于过氧化氢接骨木生物碱提取液有较好的消除作用。浓度范围为0.063 9～0.151 0 mg·mL-1，消除作用与接骨木生物碱浓度展现良好的量效关系。

3 结论

通过以上实验得出结论，对于羟自由基、超氧阴离子自由基和过氧化氢等3种自由基接骨木生物碱提取液都有较好的消除作用，且在一定浓度内呈现良好的量效关系。以上研究内容为接骨木生物碱提取分离工作奠定了实验基础，为今后其药理研究提供了实验依据。