基于宏基因组的烟田土壤细菌群落结构和功能分析

申晓晴，高华军，拓阳阳，耿召良，蔡 斌，李红丽*，王 岩

1.郑州大学生态与环境学院，郑州市高新区科学大道100 号 450001

2.中国烟草总公司海南省公司海口雪茄研究所，海口市琼山区红城湖路120 号 571100

3.四川省烟草公司凉山州公司德昌分公司，四川省西昌市三岔口东路432 号 615500

烟草黑胫病和青枯病是典型的土传病害，其直接影响烟叶的品质和产量，每年给烟叶生产造成巨大的经济损失［1-2］。烟草根腐病危害面广，防治难度大，常与黑胫病、青枯病混合发生，近年来全国核心烟区发病率呈上升趋势［3］。土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分，在维持生态平衡、物质循环和能量流动等方面发挥着重要作用［4］。有研究表明［1-2，5］，烟草土传病害的发生与土壤微生物群落结构密切相关，土壤微生物结构和功能多样性降低、有益微生物减少以及有害病原菌富集均会提高病害发生率。另外，土壤微生物在碳氮平衡中也具有重要作用。自然界中的氮素进入生态系统循环，需要微生物将氮气转化为氨或铵盐；以CO2为中心的碳循环中，微生物能通过光合作用和化能合成作用固定CO2［6］。碳氮代谢为植物生长发育提供物质基础［7］，土壤酶活性是表征土壤质量及微生物代谢活性的关键指标［8-9］，两者交互作用协同调控烟草的生长发育。因此，明确健康和易感病烟田土壤微生物群落结构差异，对病害防控尤为重要。邸慧慧等［10］研究发现，烟草病害土壤与非病害土壤样本间细菌群落结构差异较大，同源性低，且发病植烟土壤中含有大量病原菌。孙美丽等［11］研究表明，感病与健康烟叶细菌代谢通路均主要为代谢、遗传信息处理和环境信息处理3类。母少东等［12］分析了不同植烟区土壤的碳氮代谢，发现天柱地区烟叶碳氮代谢品质相关指标较威宁地区和龙岗地区协调，有利于提高烟叶品质。左梅等［13］选择不同发病程度的烟株根际土壤进行研究，发现随着烟株发病程度的增加，土壤脲酶、过氧化氢酶活性依次降低，磷酸酶和蔗糖酶活性无显著差异。丁亚茹等［14］研究了不同发病率烟田根际土壤微生物群落组成，发现已发病烟田中存在较多潜在病原菌，健康烟田中蛋白酶和过氧化氢酶的活性高于易感病烟田。然而，关于不同健康状态烟田的有益细菌群落结构及功能基因的研究还鲜见报道。为此，选取凉山彝族自治州1 块健康烟田和2 块易感病烟田为研究对象，利用宏基因组测序技术，比较不同健康状态的烟田土壤细菌群落结构、功能基因、碳氮代谢及酶活性的差异性，以期为烟田土壤健康调控提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 烟田基本情况

供试烟田位于凉山彝族自治州德昌县德州镇凤凰村（以下简称凤凰村），北纬27°25′40′′，东经102°11′17′′，海拔1 565 m，亚热带高原季风气候，年平均气温17.7 ℃，年均降水1 049 mm，无霜期300 d 以上。试验地为烟草连作10年的烟田，黄壤沙土。选取健康烟田D1，易感病（黑胫病、青枯病和根腐病混合发生，发病率50%以上）烟田D2 和D3 进行试验。每个处理面积220 m2。D1、D3前作种植油菜，D2前作种植大蒜，种植烟草品种为云烟87。

1.2 土壤样品采集

于2020年3月，即前茬作物采收后烟苗移栽前，依照5点取样法取耕层5～20 cm的土壤样品1 kg，将样品混匀并装袋编号。每块烟田取3个平行样，在田间将土样过筛（孔径0.25 mm），去除根茎、石头等杂质。取过筛后样品置于50 mL 带盖离心管中，储存于有冰袋的保温箱中，带回实验室置于-20 ℃冰柜中保存，并及时送往上海美吉生物医药科技有限公司进行宏基因组测序。其余样品部分风干用于土壤化学性质指标和酶活性分析，部分冷冻保存备用。

1.3 测定方法

1.3.1 土壤化学性质指标测定

采用电位法测定土壤pH 值［15］；采用重铬酸钾-油浴法测定有机质（Organic matter，OM）［15］；采用碱解扩散法测定碱解氮（Alkaline nitrogen，AN）［15］；采用乙酸胺提取-原子吸收法测定速效钾（Available potassium，AK）［15］；采用碳酸氢钠提取-钼锑抗比色法测定有效磷（Available phosphorus，AP）［15］。

1.3.2 土壤酶活性测定

采用对硝基苯酚比色法［16］测定酸性磷酸酶（Acid phosphatase，ACP）活性；采用靛酚蓝比色法［17］测定脲酶（Urease，URE）活性；采用3，5-二硝基水杨酸比色法［17］测定蔗糖酶（Invertase，INV）活性；采用容量法［18］测定过氧化氢酶（Catalase，CAT）活性；采用福林试剂比色法［18］测定蛋白酶（Protease，PR）活性。

1.3.3 土壤样品DNA提取、测序

使用E.Z.N.A.®Soil DNA Kit（Omega Bio-tek）试剂盒对土壤样品的基因组DNA进行提取，随后利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和纯度。通过Covaris M220（Gene Company Limited）将DNA片段化，筛选约400 bp 的片段，用于构建PE 文库。通过上海美吉生物医药科技有限公司的PE150 策略，在Illumina HiSeq X Ten 测序平台对每个文库进行测序。

1.4 数据处理

参照刘臻岳等［19］的方法进行生物信息学分析。采用Microsoft Excel 2010 进行数据统计分析和制图，采用IBM SPSS Statistics 22.0 进行方差分析，采用独立样本T检验对土壤细菌群落进行差异显著性检验，采用Duncan’s 新复极差法对土壤化学性质指标、酶活性进行差异显著性分析，采用R 语言（pheatmap package）进行相关性分析，采用上海美吉生物医药科技有限公司的生信云平台进行宏基因组数据分析。

2 结果与分析

2.1 烟田土壤细菌群落层级聚类分析

健康和易感病烟田属水平土壤细菌群落的层级聚类分析如图1所示。健康烟田D1 与易感病烟田D2、D3 的土壤细菌群落具有明显差异，易感病烟田D2和D3的土壤细菌群落相似。

图1 属水平上健康和易感病烟田土壤细菌群落的层级聚类分析Fig.1 Hierarchical cluster analysis of soil bacterial communities in healthy and susceptible tobacco fields at genus level

2.2 不同处理间土壤细菌群落组成及差异分析

健康和易感病烟田在门水平上的土壤细菌群落相对丰度如图2所示。相对丰度大于4%的优势菌门有放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）和绿弯菌门（Chloroflexi）。其中，健康烟田D1 中放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）的相对丰度较高，比易感病烟田D2和D3 分别高1.042 百分点和1.187 百分点、1.062 百分点和2.214 百分点、1.009 百分点和1.014 百分点。健康烟田D1中变形菌门（Proteobacteria）的相对丰度较低，比易感病烟田D2和D3分别低1.349百分点和3.342百分点。

图2 门水平上健康和易感病烟田土壤细菌群落的相对丰度Fig.2 Relative abundance of soil bacteria communities in healthy and susceptible tobacco fields at phylum level

健康烟田D1 和易感病烟田D2、D3 在属水平上的土壤细菌群落相对丰度如图3所示。D1、D2、D3中土壤细菌相对丰度排名前4的菌属分别为慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）、链霉菌属（Streptomyces）、罗思河小杆菌属（Rhodanobacter）和分枝杆菌属（Mycobacterium）。D1中固定杆菌属（Conexibacter）的相对丰度比D2和D3分别高0.121百分点和0.323百分点。对D1 和D2、D3 土壤细菌在属水平上有显著性差异的物种分析（图4）可知，具有显著性差异的菌属有15 个。健康烟田 D1 中慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）、链霉菌属（Streptomyces）、分枝杆菌属（Mycobacterium）、纤线杆菌属（Ktedonobacter）、鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）的相对丰度均极显著高于易感病烟田D2、D3。而易感病烟田D2、D3中罗思河小杆菌属（Rhodanobacter）的相对丰度极显著高于健康烟田D1。

图3 属水平上健康和易感病烟田土壤细菌群落的相对丰度Fig.3 Relative abundance of soil bacteria communities in healthy and susceptible tobacco fields at genus level

图4 属水平上健康和易感病烟田的土壤细菌群落差异分析Fig.4 Differential Analysis of soil bacterial community between healthy and susceptible tobacco fields at genus level

2.3 土壤细菌相对丰度与化学性质指标及酶活性的相关性分析

由表1可知，健康烟田D1中PR活性显著高于易感病烟田D2、D3，URE、ACP活性均低于易感病烟田D2、D3。健康烟田D1与易感病烟田D2中INV活性无显著差异，而易感病烟田D3中INV活性显著高于健康烟田D1。CAT活性在3块烟田中相差不大。健康烟田D1中土壤OM、AN、AK、AP含量均显著低于易感病烟田D2、D3。

表1 不同烟田土壤酶活性、化学性质指标的差异分析①Tab.1 Differential analysis of soil enzyme activity and chemical properties between different tobacco fields

在属水平上，对烟田土壤细菌相对丰度与土壤化学性质、酶活性进行Spearman相关性热图分析，结果如图5所示。pH 值、OM、AN、AP、AK、PR、URE、ACP是土壤细菌群落在属水平上具有显著影响的因子。慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）、链霉菌属（Streptomyces）、分枝杆菌属（Mycobacterium）、固定杆菌属（Conexibacter）的相对丰度与AN、AP、AK、URE呈极显著正相关，与PR呈极显著负相关。纤线杆菌属（Ktedonobacter）与PR 呈极显著正相关，与AN、AP、AK、URE 呈极显著负相关。罗思河小杆菌属（Rhodanobacter）和鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）的相对丰度与pH 值呈极显著负相关，与OM、ACP 呈极显著正相关。

图5 属水平上烟田土壤细菌群落与化学因子及酶活性间的相关性热图Fig.5 Correlation heatmap of soil bacterial community with chemical factors and enzyme activity at genus level in tobacco fields

2.4 烟田土壤样品功能基因预测分析

通过Diamond将非冗余基因集序列与KEGG的基因数据库进行比对注释，发现3块烟田土壤样品中共含有6类一级功能代谢通路和46类二级功能代谢通路。由图6a可见，KEGG一级功能代谢通路中，与代谢相关的基因丰度最高，其次为遗传信息处理、环境信息处理、细胞过程、人类疾病和有机系统。其中，D1、D2、D3 中与代谢相关的基因丰度占各样品总基因丰度的比例分别为72.36%、71.95%、71.81%。D2 和D3 中6 类一级功能代谢通路的基因丰度均高于D1。

图6 KEGG一级和二级功能代谢通路Fig.6 KEGG primary and secondary functional metabolic pathways

在二级KEGG 的基因数据库中，对46 类二级功能代谢通路中基因丰度排名前12的代谢相关功能基因进行注释，结果如图6b所示。D1、D2、D3 中碳水化合物代谢和全局概览通路为主要二级功能代谢通路，其次为氨基酸代谢、能量代谢、核苷酸代谢及辅酶维生素代谢。综合图6a 和图6b 可见，D1、D2、D3 中一级功能代谢通路与二级功能代谢通路的基因丰度呈现一定的规律性，即D2＞D3＞D1。

含碳有机物质是微生物的主要能源和碳源。土壤微生物碳代谢途径多样，主要有三羧酸循环、卡尔文循环、二羧酸-羟基丁酸循环和3-羟基丙酸双循环［6］。利用宏基因组技术检测到的烟田土壤碳代谢基因调控三羧酸循环、糖酵解途径和糖异生途径。图7a为土壤碳代谢基因编码的酶及其调节的代谢途径，可见甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、磷酸甘油酸激酶（PGK）、磷酸甘油酸变位酶（gpmB、gpml、APGM）、2，3-二磷酸甘油酸依赖性磷酸甘油酸变位酶（PGAM）、烯醇酶（ENO）、丙酮酸激酶（pyK）、丙酮酸脱氢酶（aceE、aceF、PDHA、PDHB）调节糖酵解和糖异生途径；柠檬酸合成酶（gltA）、异柠檬酸脱氢酶（ICD）、苹果酸脱氢酶（MDH）调节三羧酸循环（TCA）。这表明糖酵解和糖异生途径在烟田土壤碳循环过程中较为活跃。

图7 土壤碳循环示意图（包含糖酵解、糖异生和三羧酸循环）和碳代谢基因丰度热图Fig.7 Soil carbon cycle diagram（including glycolysis，gluconeogenesis and tricarboxylic acid cycle）and carbon metabolism gene abundance heatmap

图7b 为碳代谢基因丰度热图，可见二羧酸-羟基丁酸循环相关基因（atoB、coxL、ACSS）和三羧酸循环相关基因（pdhD、fdfH、sdhA、gltA、aceF、aceE、korA）丰度占比较高。这表明烟田主要固碳途径为二羧酸-羟基丁酸循环和三羧酸循环。综合图7a和图7b可见，上述酶基因丰度呈现出健康烟田D1高于易感病烟田D2、D3的规律性。

利用宏基因组技术检测到的烟田土壤氮代谢基因，调控硝酸盐还原、异化硝酸盐还原、硝化、反硝化、固氮和谷氨酸合成［6］。由此，绘制凤凰村烟田土壤氮循环示意图，并标注出相关过程的酶基因，如图8a所示。调控亚硝酸盐还原（Nitrite reduction）和一氧化氮还原（Nitric-oxide reduction）的功能基因占7.90%，调控硝酸盐还原（Nitrate reduction）的功能基因占31.70%，调控羟胺氧化（Hydroxylamine oxidation）和一氧化二氮还原（Nitrous-oxide reduction）的功能基因占3.69%，调控氨氧化（Ammonia oxidation）和固氮（N fixation）的功能基因占11.20%，调控谷氨酸合成（Glutamate synthesis）的功能基因占32.70%。烟田土壤中谷氨酰胺合成酶（glnA）、谷氨酸合成酶（gltB、gltD）、谷氨酸脱氢酶（GDH2、gdhA）、同化硝酸盐还原酶（nasA、narG、narH、narL、nasB）、亚硝酸还原酶（nirK、nirA、nirB）、一氧化氮还原酶（norB）、氧化亚氮还原酶（nosZ）、亚硝酸盐氧化还原酶（nxrA、nxrB）活性较高。

图8 土壤氮循环示意图和氮代谢基因丰度热图Fig.8 Soil nitrogen cycle diagram and nitrogen metabolism gene abundance heatmap

由氮代谢基因丰度热图（图8b）可见，烟田土壤谷氨酸合成基因（glnA、GDH2、gdhA、gltB、gltD）、反硝化基因（narG、narH、nasA、narL、nasB、norB、nirK）、硝化基因（nxrB、nxrA）丰度较高。这表明烟田土壤氮代谢以谷氨酸合成、反硝化和硝化作用为主。在反硝化过程中，健康烟田D1土壤氮代谢基因nasA、narG、narH、narL、napA、nasB、nirK、nirS、norB、norC、nosZ的丰度均低于易感病烟田D2、D3。

3 讨论

不同健康状态的烟田中土壤微生物群落组成不同［20］。健康与易感病烟田土壤细菌群落结构有明显差异。在凤凰村健康和易感病烟田土壤中，放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）和绿弯菌门（Chloroflexi）为优势菌门，与黄阔等［21］和WU X 等［22］发现的优势菌门结果一致。优势菌属慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）、链 霉 菌 属（Streptomyces）、分 枝 杆 菌 属（Mycobacterium）为有益菌属［23-25］，这3个优势有益菌属在健康烟田D1 中的相对丰度均极显著高于易感病烟田D2、D3。慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）在农田环境和作物根际中发挥较大的固氮潜能，为重要的植物根际促生菌［23-24］；链霉菌属（Streptomyces）为拮抗菌，产生多种抗生素，对烟草土传病害有一定的生防作用［25］；分枝杆菌属（Mycobacterium）能够拮抗多种细菌产生的病害［25］。非优势菌属固定杆菌属（Conexibacter）、纤线杆菌属（Ktedonobacter）、鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）为有益菌属［26-29］，这3 个非优势有益菌属在健康烟田D1 中的相对丰度均高于易感病烟田D2、D3。固定杆菌属（Conexibacter）可增强土壤微生物群落的稳定性，在土壤-植物系统的氮循环中发挥作用［26］；纤线杆菌属（Ktedonobacter）为土壤中有益菌属［27］；鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）可抵抗多种病原菌［28］，具有显著的生物降解和生物合成能力，在维持土壤氮平衡方面起着重要作用［29］。慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）和鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）属于变形菌门，链霉菌属（Streptomyces）、分枝杆菌属（Mycobacterium）和固定杆菌属（Conexibacter）属于放线菌门。徐新雯等［30］和Trivedi等［31］等研究发现，放线菌门丰度越高，烟田土壤抗病能力越大，可能是因为大部分微生物具有较强的抗病性。健康烟田土壤环境有利于这些有益菌属的生长，可在一定程度上抵制病原菌生长以减少土传病害的发生。

本研究中易感病烟田D2、D3的各项土壤化学性质均高于健康烟田D1，这可能是因为易感病烟田的根系活动下降，吸收养分的能力变弱，导致易感病烟田土壤养分含量过剩，且崔永和［32］研究表明富营养化会导致烟草病害频发。土壤酶活性是反映土壤质量和生物活性的重要指标［33-34］。本研究中易感病烟田D2、D3 的URE、ACP 活性高于健康烟田，易感病烟田D3的INV活性高于健康烟田，初步推测可能与易感病烟田中各项化学性质指标均高于健康烟田有关，但其作用机制还有待深入研究。URE 受土壤微生物数量、有机质含量影响，可反映土壤中氮素情况［35］；ACP参与土壤磷的循环，可以将有机形式的磷转化为可被植物利用的无机磷［36］；INV 可促进土壤中有机质的分解，提升土壤肥力水平［36］。本研究中健康烟田D1 的PR 活性显著高于易感病烟田D2、D3。PR可将土壤中蛋白质分解成氨基酸，是提高烟叶质量的一种有效方法［37］。

本研究中3 块烟田土壤的6 类一级功能代谢通路中代谢的基因丰度最高，且占比均超过70%，说明土壤微生物的代谢旺盛，与刘坤和等［38］的研究结果一致。土壤微生物代谢是各菌属与环境之间的物质和能量交换过程［39］。本研究中易感病烟田D2、D3的功能基因丰度占比较高，这与张仁军等［40］的研究结果基本一致，推测其代谢相关的功能基因与烟草病害的发生密不可分，但其作用机制还有待进一步研究。

4 结论

宏基因组技术检测分析表明，健康烟田细菌的组成、相对丰度与易感病烟田之间存在差异。健康烟田中有益菌属的相对丰度高于易感病烟田，而易感病烟田土壤细菌群落结构失衡，有益菌减少，对病原菌的拮抗能力减弱。土壤微生物碳代谢途径以三羧酸循环、糖酵解和糖异生途径为主，健康烟田土壤中关键酶基因丰度均高于易感病烟田。土壤微生物氮代谢途径以谷氨酸合成、硝化和反硝化过程为主，健康烟田反硝化过程中酶基因丰度低于易感病烟田。