依匹哌唑对结肠癌细胞系HCT116和SW620细胞内胆固醇合成的影响及其机制

李婷，龙小艺，刘肖洁，陈卫

川北医学院基础医学与法医研究所，四川 南充 637000

结直肠癌是世界上最常见的三大癌症之一，发病率和死亡率都很高［1］。在目前手术、化疗、放疗等标准治疗下，结直肠癌患者5年相对生存率为65%。然而，在IV 期结直肠癌患者中，这一比例降至12%［2］。因此，寻找新的抗癌机制和药物对结直肠癌的防治具有重要意义。到目前为止，已有多项研究［3］发现结直肠癌与血清高胆固醇水平之间存在关联，这意味着结直肠癌的发生进展与胆固醇合成代谢密切相关。胆固醇是细胞的能量来源之一，可由哺乳动物细胞通过甲羟戊酸途径合成［4］。此外，胆固醇还参与细胞膜的合成，并作为信号分子参与信号级联［5-6］。因此，胆固醇合成代谢在肿瘤发生发展中起着重要作用［7］。近年来，非典型抗精神病药物被报道对多种癌症有潜在的治疗效果［8］，比如新型抗精神病药物依匹哌唑。2015年，依匹哌唑被FDA批准用于治疗重度抑郁和成人精神分裂症，不良反应小且安全性好［9］。研究［10-12］表明，依匹哌唑具有一定的抗癌作用，可在胰腺癌、非小细胞肺癌、胶质母细胞瘤的癌细胞和癌症干细胞中发挥抗癌效应。然而依匹哌唑在结直肠癌中的作用及其机制尚不明确。2022年10月—2013年2月，我们观察了依匹哌唑对结肠癌细胞系HCT116 和SW620 细胞内胆固醇合成的影响，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 依匹哌唑、细胞、试剂 依匹哌唑购于上海毕得医药科技有限公司。人结肠癌细胞系HCT116 和SW620 均购买于武汉普诺赛生命科技有限公司。McCoy's 5A 培养基购自索莱宝公司；胎牛血清、DMEM 培养基、双抗购自Gibco公司。CCK-8试剂购自Dojindo 公司。逆转录酶试剂盒、PCR 扩增试剂（TB Green®Premix Ex Taq™ Ⅱ）购于日本TaKaRa 公司。所用引物由Primer6 软件设计并由上海生工公司合成。总胆固醇（TC）检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所有限公司。

1.2 细胞培养及分组 HCT116、SW620 细胞分别选用McCoy's 5A 培养基、DMEM 高糖培养基在5%CO2、37 ℃的环境中进行培养，培养基中均添加有10% FBS 及1% 双抗。取对数生长期HCT116、SW620 细胞，分别分为依匹哌唑组和对照组，依匹哌唑组加入含20 μmol/L 依匹哌唑的培养基，对照组加入等量完全培养基，各组细胞继续培养24 h 后用于后续实验。

1.3 两组细胞中总胆固酮（TC）检测 采用微板法。取两组细胞，胰酶消化、PBS 重悬后加入96 孔板中，使用超声破碎机破碎细胞20 min，加入TC 测定试剂，使用酶标仪于510 nm 处测定细胞OD 值，计算各组细胞中TC含量。

1.4 两组细胞中人3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A 还原酶（HMGCR）、人3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶1（HMGCS1）mRNA和蛋白检测

1.4.1 两组细胞中HMGCR、HMGCS1 mRNA 检测 采用实时荧光定量PCR 法。取两组细胞，使用TRIzol 试剂提取细胞总RNA，取1 μg 总RNA 逆转录为cDNA 后，使用SYBR Premix Ex TaqTM 试剂进行PCR 扩增。引物序列如下：HMGCR 上游引物为5′-TGATTGACCTTTCCAGAGCAAG-3′，下游引物为5′-CTAAAATTGCCATTCCACGAGC-3′；HMGCS1 上游引物为5′-CATTAGACCGCTGCTATTCTGTC-3′，下游引物为5′-TTCAGCAACATCCGAGCTAGA-3′；内参基因GAPDH 上游引物为5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物为3′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-5′。反应体系：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 12.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DNA 模板2 μL，灭菌水8.5 μL。PCR 反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，共40 个循环。以2-ΔΔCt表示目的基因的相对表达量。

1.4.2 两组细胞中HMGCR、HMGCS1 蛋白检测采用Western Blotting 法。取两组细胞，用RIPA 裂解液（含PMSF、磷酸酶抑制剂）于4 ℃裂解30 min 后离心提取总蛋白。通过SDS-PAGE 胶分离出蛋白，并转移到PVDF 膜上，快速封闭液封闭10 min，4 ℃分别敷育一抗，β-actin（1∶2000）、HMGCR（1∶2000）、HMGCS1（1∶1000）过夜。次日，洗膜后敷育二抗1 h后，将显影液滴加在PVDF 膜上，用ECL 化学发光仪显影并拍照。以β-actin 为内参，以目的蛋白电泳条带灰度值与内参蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

1.5 两组细胞中PI3K/Akt-SREBP2 信号通路蛋白p-PI3K、p-AKT、SREBP2 表达检测 采用Western Blotting 法。检测步骤参照“1.4.2”，一抗浓度分别为p-PI3K（1∶1000）、p-AKT（1∶1000）、SREBP2（1∶1000），以β-actin为内参，以目的蛋白电泳条带灰度值与内参蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

1.6 统计学方法 采用SPSS24.0 和Graphpad Prism 5.0统计软件。计量资料呈正态分布时以±s表示，比较用配对t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组细胞中TC 含量比较 对照组、依匹哌唑组HCT116 细胞中TC 含量分别为（0.210± 0.054）、（0.039± 0.022）gprot/L，两组相比，P＜0.05。对照组、依匹哌唑组SW620 细胞中TC 含量分别为（0.140± 0.025）、（0.014± 0.007）gprot/L，两组相比，P＜0.05。

2.2 两组细胞中HMGCR、HMGCS1 mRNA 和蛋白相对表达量比较

2.2.1 两组细胞中HMGCR、HMGCS1 mRNA 相对表达量比较 对照组、依匹哌唑组HCT116 细胞中HMGCR mRNA 相对表达量分别为1.00± 0.00、0.61± 0.02，两组相比，P＜0.05；对照组、依匹哌唑组HCT116 细胞中HMGCS1 mRNA 相对表达量分别为1.00± 0.00、0.56± 0.03，两组相比，P＜0.05。对照组、依匹哌唑组SW620 细胞中HMGCR mRNA 相对表达量分别为1.00± 0.00、0.70± 0.02，两组相比，P＜0.05；对照组、依匹哌唑组SW620 细胞中HMGCS1 mRNA 相对表达量分别为1.00± 0.00、0.53± 0.03，两组相比，P＜0.05。

2.2.2 两组细胞中HMGCR、HMGCS1 蛋白相对表达量比较 对照组、依匹哌唑组HCT116 细胞中HMGCR 蛋白相对表达量分别为2.10± 0.10、0.50± 0.14，两组相比，P＜0.05；对照组、依匹哌唑组HCT116 细胞中HMGCS1 蛋白相对表达量分别为3.00± 0.20、1.10± 0.09，两组相比，P＜0.05。对照组、依匹哌唑组SW620 细胞中HMGCR 蛋白相对表达量分别为1.30± 0.02、0.33± 0.04，两组相比，P＜0.05；对照组、依匹哌唑组SW620 细胞中HMGCS1蛋白相对表达量分别为1.10± 0.06、0.36± 0.06，两组相比，P＜0.05。

2.3 两组细胞中p-PI3K、p-AKT、SREBP2 蛋白相对表达量比较 对照组、依匹哌唑组HCT116 细胞中p-PI3K 蛋白相对表达量分别为2.20± 0.18、0.28±0.12，两组相比，P＜0.05；对照组、依匹哌唑组HCT116 细胞中p-AKT 蛋白相对表达量分别为1.60± 0.14、0.46± 0.25，两组相比，P＜0.05；对照组、依匹哌唑组HCT116细胞中SREBP2蛋白相对表达量分别为2.20± 0.05、1.60± 0.02，两组相比，P＜0.05。对照组、依匹哌唑组SW620 细胞中p-PI3K 蛋白相对表达量分别为0.87± 0.13、0.10± 0.05，两组相比，P＜0.05；对照组、依匹哌唑组SW620细胞中p-AKT 蛋白相对表达量分别为0.62± 0.07、0.29±0.05，两组相比，P＜0.05；对照组、依匹哌唑组SW620 细胞中SREBP2 蛋白相对表达量分别为0.95± 0.07、0.20± 0.04，两组相比，P＜0.05。

3 讨论

结直肠癌的发生是一个缓慢、隐匿、多步骤的发展过程，从癌前病变到结直肠癌需要5～10年时间［13］，并且与患者一些风险因素（年龄、性别和家族易感体质）和环境（饮食、超重和吸烟）密切相关［14］。高胆固醇血症已被认为是癌症的重要危险因素。除血清胆固醇外，细胞内胆固醇也被证明在肿瘤进展的调节中起着至关重要的作用。研究［15］显示，在肿瘤组织中细胞内胆固醇水平也升高，并促进了癌细胞的增殖、迁移和侵袭。靶向胆固醇合成途径已被认为是一种抗肿瘤的策略［16］。

本研究证实，依匹哌唑能显著降低结肠癌细胞内TC 含量，并下调胆固醇合成关键酶HMGCR 和HMGCS1 的表达，这些结果表明依匹哌唑能抑制结肠癌细胞内胆固醇合成。多项研究证实HMGCR 在胶质母细胞瘤、胃癌和前列腺癌细胞中有致癌作用，另有研究［17-18］表明HMGCR 还与结直肠癌的预后有关。此外，有报道［19-20］称HMGCS1 在乳腺癌和胃癌中促进肿瘤生长。相反，抑制HMGCS1 可抑制结直肠癌细胞的增殖［21-22］。

固醇调节元件结合蛋白（SREBPs）是一个转录因子家族，由SREBP-1a、SREBP-1c和SREBP2组成。SREBP前体（SREBP-P）在内质网膜上合成。在成熟时，SREBP 进入细胞核并促进脂肪生成基因的转录。SREBP2 主要通过调节胆固醇合成关键酶（如HMGCR 和HMGCS1）的表达进而影响胆固醇代谢［23］。Western Blotting 结果显示，依匹哌唑显著下调了SREBP2 蛋白表达。SREBP2 已被证实在多种癌症中高表达，并促进肿瘤发生和进展。最近的一项研究［24］阐明了SREBP2 介导的胆固醇生物合成对结直肠癌的生长是必不可少的。PI3K/Akt 通路激活后通过调节SREBPs 的表达在脂质合成中发挥关键作用，许多研究也表明SREBPs 与PI3K/Akt 通路密切相关，从而促进细胞生长和存活［25］。本研究结果表明，依匹哌唑可抑制结肠癌细胞p-PI3K、p-AKT和SREBP2蛋白的表达。

综上，依匹哌唑可抑制HCT116 和SW620 细胞的细胞内胆固醇合成，其机制可能与依匹哌唑抑制PI3K/Akt-SREBP2信号通路蛋白的表达有关。本研究为挖掘依匹哌唑新的药用价值提供了实验基础和理论依据，然而，依匹哌唑是否通过调节胆固醇合成发挥抗结直肠癌作用，仍需深入探究。此外，本研究仅局限在细胞层面，后续还将进行动物实验进一步验证。