空间分辨代谢组学在疾病诊断研究中的应用进展

何诗瑜 曾仲大 李博岩

（1. 贵州医科大学公共卫生与健康学院，贵阳 550025； 2. 大连大学环境与化学工程学院，大连 116622）

代谢组学（metabolomics）是继基因组学和蛋白质组学之后新近发展起来的一门学科。它是以组群指标分析为基础，以高通量检测和数据处理为手段，以信息建模与系统整合为目标的系统生物学的重要组成部分，尽可能对某一生物或细胞在特定生理时期内所有低分子量代谢产物进行定性和定量分析。与基因组学、蛋白质组学和转录组学相比，代谢组学最接近生物表型，更能直观地反映生物或细胞的生理或病理状态［1］。因此，代谢组学发展迅速并渗透到多项领域，比如疾病诊断、医药研发、营养食品科学、毒理学、环境学、植物学等与人类健康护理密切相关的领域［2-4］。然而，生物体内代谢物的产生、累积和消耗的全过程常伴随着时空特征的变化，并影响着生物体的生理功能［5］。基于色谱-质谱联用技术的传统代谢组学，具有高敏感度、高选择性、高分离效率、动态范围宽、信息丰富等特点［6-7］，但往往不可避免地在样本前处理过程中几乎完全丢失了代谢物的空间分布信息，导致该技术在生物体的状态及功能分析中存在一定的局限性。因此，如何获取代谢物在时间和空间上的异质性是破译生物体复杂的生理病理变化的关键。

2007年Watson等［8］首次提出基于激光切割显微镜技术的空间分辨代谢组学（spatially resolved metabolomics，SRM）。经过十几年的快速发展和技术更新，越来越先进的成像技术使得SRM成为研究生命科学领域中植物、动物组织以及单细胞等结构和功能的强大工具［2,9-11］。图1描绘了空间分辨代谢组学的发展历程。简单来说，空间分辨代谢组学是利用高灵敏度、高分辨率的质谱成像技术产生数据，以化学计量学、生物信息学和多组学等综合方法为支撑，研究动物、肿瘤、植物等组织中各种代谢路径的底物和产物的小分子代谢物，从高覆盖度的数据中识别高特异性、高异质性信息，解析疾病分子机制、发育学、肿瘤代谢与免疫、分子病理诊断、肿瘤耐药与精准用药、环境毒理学、新药药理和毒理、基因调控机制、植物药用成分定位，从而解决医学、农林牧渔领域难题的新型分子成像组学技术［12-13］。空间分辨代谢组学在疾病诊断和寻找生物标志物等方面展现出较好的潜力，如辅助诊断结直肠癌［14］、乳腺癌［15］、前列腺癌［16］、非小细胞肺癌［17］及糖尿病肾病［18］等。本文总结了近年来代谢组学、质谱成像技术、空间分辨代谢组学的研究现状及其在疾病诊断上的应用进展，并展望空间分辨代谢组学的应用前景，以期为空间分辨代谢组学在疾病诊断、疾病分子机制研究以及药物研究开发等领域的应用提供参考。

图1 空间分辨代谢组学发展历程图Fig. 1 Brief timeline of spatially resolved metabolomics

1 空间分辨代谢组学

1.1 代谢组学

代谢组学研究最早始于20世纪末，首次由Nicholson等［19］提出并将其定义为研究生物体、组织或细胞在一定条件下实施前后的低分子量代谢产物（100-1 500 Da）的定性及动态变化的定量测定［20］。该技术可对生物体生理病理改变与代谢产物间关系进行系统性分析［21］。代谢组学可通过对病理变化的生物体、组织或细胞中的代谢物谱、代谢表型、代谢变化、代谢途径与正常个体间进行差异分析，从而发现具有特定识别作用的生物标志物，并将获取的生物标志物作为疾病诊断或风险评估的指标［22］。代谢组学研究方法主要包括两种。一种是采用液相色谱-质谱等技术的代谢物指纹分析（metabolomics fingerprinting），涉及比较不同个体中代谢产物的质谱峰，最终了解不同化合物的结构，建立特征化合物识别的分析方法。另一种是代谢轮廓分析（metabolomics profiling），通过假定特定的代谢途径深入探讨代谢机制问题。例如，Brindle等［23］利用核磁共振仪获取冠心病患者血样中的内源代谢物谱及数据，建立了高效准确的冠心病诊断模型，对冠心病进行了分期分类，为早期冠心病预防、发现，以及诊断提供了一定的参考。Denkert等［24］用GC-TOF-MS技术发现结肠癌组织代谢物的显著差异性。Sreekumar等［25］利用LC-GC-MS技术检测尿样和血浆，通过得到的代谢物谱判断前列腺癌的发生发展。越来越多的研究表明多种疾病与组织细胞所处的环境、营养状态以及代谢活动息息相关，因此，从代谢物层面开展疾病诊断的组学研究具有广泛的应用前景。

1.2 质谱成像技术

代谢组学研究最常用的分析技术是色谱-质谱联用，其中极性代谢物在液相色谱-串联质谱（LCMSn）中有较好的相容性，能够在单次分析中获得数千种代谢物信息，使得LC-MSn在血液、尿样和细胞等生物样本的代谢组学分析中占据重要地位。但是，该技术需要先从具有代表性的组织器官样本匀浆中提取分子物质，经过液相分离、纯化、富集过程，再进行定性定量检测，最终得到代谢物平均水平。这些复杂的处理过程不仅破坏了样品的原有组织结构，丢失了代谢物在组织中的空间分布信息，还会掩盖相关代谢物的特异性或异质性。而质谱成像（mass spectrometry imaging, MSI）是一种以质谱为基础的新型分子影像技术，能够直接在组织或细胞水平获得大量已知或未知的内源性代谢物和外源性药物等分子的结构、含量和空间分布信息，具有高灵敏度、无需标记、可视化检测、覆盖范围大、高特异性、高通量和空间信息保留等突出优点（表1），率先被运用于蛋白组学和脂质组学研究［26-27］。MSI技术结合生物信息学，发展成为空间代谢组学方法，突破了传统代谢组研究损失空间信息的瓶颈，可实现生物组织中上千代谢物的定性、定量和定位分析［3］，从生物组织原位发现差异代谢物，并识别其生物学功能。例如，使用MSI技术研究脂类代谢物的含量变化与肿瘤疾病间的关联性［28］发现，药物作用靶点和生物标志物以及助力脑神经类疾病的诊治等［29］。

表1 常用代谢组学检测方法Table 1 Typical metabonomic detection methods

根据离子源的不同，MSI技术可分为基质辅助激光解吸电离质谱成像（matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging, MALDI-MSI）、二次（次级）离子质谱成像（secondary ion mass spectrometry imaging, SIMS imaging）、激光溅射电喷雾电离质谱成像（laser ablation electrospray ionization mass spectrometry imaging, LAESI-MSI）、解吸电喷雾电离质谱成像（desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging, DESI-MSI）、空气动力辅助解吸电喷雾电离质谱成像（airflow-assisted desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging, AFADESI-MSI）等（表2）。MSI离子源的工作原理如图2所示。其中，MALDI-MSI具有稳定性好、灵敏度高、受干扰小、空间分辨率可达1.4 μm的特点，是目前主流且应用最广泛的质谱成像技术［30-31］。MALDI-MSI的原理是基质分子能从波长为337 nm或355 nm的紫外激光中吸收能量，与样品成为共晶体或成为附着样品的薄膜，样品由基质提供的能量发生电离，通过检测不同质荷比的样品碎片而获取样品物质的分子量信息。对于含水量大的样本可采用LAESI-MSI技术，其利用样本中所含的水作为基质，避免了复杂基质的干扰，并采用电喷雾（ESI）促进电离，降低了对样本制备的需要，提升了样本检测效率且其空间分辨率达100 μm［32］。SIMS-MSI技术的空间分辨率最高，其中动态SIMS能达到20-50 nm的超高空间分辨率。但因其使用的高能溅射离子束束流极大，易将分子破坏为原子离子，无法获取完整的分子信息，故在代谢物成像上的应用并不广泛。静态SIMS能够获取部分小分子物质，一般分子量不超过1 000 Da，如代谢物、脂质类等化合物信息，其在多数情况下以飞行时间二次离子质谱成像（timeof-flight SIMS imaging, TOF-SIMS imaging）广泛应用在生命科学领域［33］。DESI-MSI与前二者不同，可在常压下完成待测物的离子化与成像。然而，其空间分辨率约为200 μm，限制了DESI-MSI技术在实际的空间分辨代谢组学中的应用［34］。再帕尔·阿不力孜等在DESI-MSI的基础上升级并研发了新型常压敞开离子化质谱成像技术AFADESI-MSI［35-36］。该方法具有高灵敏度、高特异度、高覆盖度以及普适无针对性等优点，能可视化分析多种代谢物的原始空间分布，极大地有助于开展分子组织学与分子病理学研究。

表2 常用质谱成像技术Table 2 Typical mass spectrometry imaging techniques

图2 常见MSI离子源示意图Fig. 2 Schematic diagram of typical mass spectrometry imaging ion sources

1.3 空间分辨代谢组学

代谢组学的迅速发展让人们对其充满期待：寻找新的生物标志物，发现新的代谢途径，或者更加深入地了解已知的代谢途径。然而，识别代谢产物并进一步确认所有代谢物的功能却是代谢组学研究的最大挑战。主要原因是传统代谢组学侧重于相关特定代谢产物的共性研究，组织样本中各组分的同质性和均匀性与最终要涉及研究的各个代谢组分的共性、特性和规律的目标相距甚远。于是，研究人员尝试从代谢物的时间和空间含量变化着手，将高分辨成像技术引入代谢组学［9］，阐述代谢物的时空分布特征，进而反映生物体生理病理变化。例如，Sun等［11］利用MSI技术可视化癌组织中差异代谢物在空间上的区域特异性分布，使研究对象从组织、器官水平向单细胞水平拓展，从点到面地获取多维度代谢物信息［37］。由此出现了空间分辨代谢组学或称为空间代谢组学，并逐渐成为当前研究的热点之一［38-39］。空间代谢组学的关注点是：（1）内源性代谢物和外源性物质，（2）结构复杂和高异质性的生物组织或器官中小分子代谢产物的定性、定量、定位分析，（3）各种代谢物在不同时间点的原位分析，（4）差异性代谢物结构、含量、动态变化及空间分布特征，（5）代谢物的上调或下调指示与疾病、毒性、基因修饰或环境因子的影响，（6）生物标志物用于疾病的诊断和药物的筛选。空间分辨代谢组学凭借全景描绘生物体系中代谢相关分子时间动态变化和空间分布特征的能力，与生理学的联系更为紧密。疾病导致机体病理生理过程变化，最终引起代谢产物发生相应的改变，通过分析某些代谢产物，寻找疾病的生物标志物，可以提供一种较好的疾病诊断方法。图3概括了空间分辨代谢组学研究的基本工作流程。空间分辨代谢组学有助于解决疾病分子机制、肿瘤代谢、免疫及分子病理诊断等有关的生物学问题，在临床疾病诊断应用中备受关注，为组织代谢异质性识别和细胞分子可视化分析提供了新视角和创新手段。

图3 空间分辨代谢组学工作流程图Fig. 3 Workflow of spatially resolved metabolomics

2 空间分辨代谢组学研究现状及其在疾病诊断中的应用

2.1 空间分辨代谢组学在肿瘤诊断上的应用

与肿瘤相关的疾病已经成为重大的公共卫生与健康问题，给患者、家属以及社会都造成持续的巨大经济负担。代谢组学通过运用现代仪器技术获取高通量数据，定性定量分析代谢物信息，在高特异性的生物标志物的筛选方面发挥着重要的作用，有效地辅助肿瘤相关疾病的快速诊断和治疗。空间分辨代谢组学可以直接定位代谢物的空间分布，对代谢物进行可视化检测。尤其是空间分辨代谢组学的“下游代谢物与上游代谢酶关联”策略的提出，使得肿瘤代谢信息改变表征可视化成为可能，因而发现了与肿瘤细胞相关的小分子差异代谢物，了解到癌症的分子分型和肿瘤异质性［11,13］。异质性甲状腺乳头状癌的空间代谢组学研究表明肿瘤组织与其相邻的正常组织之间的代谢产物中氨基酸和肌酐的表达存在差异［40］。食管鳞癌中与肿瘤密切相关表达异常的6种代谢酶中的吡咯啉-5-羧酸还原酶家族成员2（PYCR2）和尿苷磷酸化酶1（UPase1）在癌组织中存在差异性表达［11］，预示可通过下游代谢物来获取上游代谢酶的变化，从而了解疾病的代谢途径。Andersen团队借助MALDI-TOF MSI检测前列腺癌冷冻组织核心样本，观察到样本的不同组织区域具有不同的代谢特征与代谢物水平，用MSI在人体前列腺癌组织中检测到精胺减少，将发现的差异代谢物与脂质（溶血卵磷脂LPC）用作诊断前列腺癌和判断预后的生物标志物［16］，证明了MSI空间代谢组学能够提供病理组织和正常组织间代谢物的水平差异和空间信息，是临床上诊断疾病潜在有力的创新工具。Sun等［41］利用空间分辨代谢重新编码，对乳腺癌中肉碱的新陈代谢进行了可视化分析发现，肉碱棕榈基转移酶spa1A（CPT 1A）、肉碱棕榈基转移酶2（CPT 2）和肉碱乙酰转移酶（CRAT）表达异常，为肿瘤的早诊断提供了新思路。Chen等［14］利用AFADESI-MSI技术对9对人类结直肠腺瘤/肿瘤和癌旁活检组织样本进行空间代谢组学分析发现，腺瘤/肿瘤组织中的N,O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺丰度有所上调，并在结直肠异常的患者血清中观察到该代谢物的变化。非靶向与靶向代谢组学分析结果发现结直肠异常与代谢特征存在关联性，可用于诊断结直肠腺瘤及结直肠癌。

很多肿瘤相关疾病的研究表明生物分子丰度的空间信息与变化能反映疾病的发生发展，例如可作为早期癌症诊断的生物标志物的脂质类化合物［42］，其组成的复杂性和多样性致使在检测与定量分析方面存在困难。然而，MSI通过可视化癌症组织中的脂质分布与丰度变化，在很大程度上能够克服这样的困难［43］，深入了解癌症的发展与诊断。DESI-MSI用于区分胰腺癌和正常胰腺组织发现，癌组织中多不饱和脂肪酸的相对丰度较高，如花生四烯酸（m/z 303.3）和肾上腺素酸（m/z 331.2）［44］。通过检测脂质相对丰度的差异结合组织病理诊断学快速鉴别胰腺癌组织，指导胰腺癌诊断和治疗。利用DESI-MSI在200 μm的空间分辨率下原位观察人类黑色素细胞瘤组织内大量极性和非极性脂质的特异性分布，与免疫组化技术和多元统计分析相结合，确定胆固醇为诊断黑色素细胞瘤的潜在生物标志物［45］。此外，研究发现在人类肾脏的近端小管区域及皮质、髓质等组织中的N-聚糖与肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma, ccRCC）的发展密切相关［46］，可特异性地判别肿瘤，揭示了MSI具有被应用在鉴别和诊断肿瘤上的可能性。

2.2 空间分辨代谢组学在神经精神疾病上的应用

近年来有关神经精神疾病早期诊断的研究表明空间分辨代谢组学可辨别不同疾病间的差异性代谢物，发现了用于辅助疾病诊断的生物标志物［47-48］。Pang等［49］利用AFADESI-MSI技术映射正常大鼠、阿尔兹海默病（Alzheimer’s disease, AD）大鼠及东莨菪碱给药治疗的AD大鼠脑组织中的代谢网络，鉴定出腺嘌呤、透明质酸、磷酸乙醇胺等20余种异常代谢产物，了解到这些代谢产物的含量变化与其在大脑微区中的分布有关［50-51］，为神经退行性疾病诊断提供了新的可能性。癫痫是一种脑部慢性非传染疾病，影响全球众多人口健康，其中尤以颞叶癫痫（temporal lobe epilepsy, TLE）最为普遍。利用DESI-MSI空间分辨代谢组学分析患者大脑海马体中的代谢物质，了解到造成癫痫疾病的可能原因是Kennedy代谢途径失调导致磷脂酰胆碱（PC）和磷脂酰乙醇胺（PE）的表达降低［52］。在空间分辨代谢组学探讨多发性硬化症发生机制研究中发现，多发性硬化中再髓鞘化形成的新髓鞘与正常髓鞘间存在不同的脂质结构和成分［53］，这些物质可以辅助疾病诊治。Vendramini等［54］通过DESI-MSI技术验证了精神分裂症患者脑中的磷脂酰胆碱含量差异与膜磷脂分解导致该物质含量降低的一致性。精神分裂症患者对抗精神病药物的耐药性的MSI研究［55］说明SRM具有用于精神疾病临床诊断的可能性。应用MSI检测创伤性脑损伤（traumatic brain injury, TBI）前后脂质表达发现，伤后不同时期的小胶质细胞分泌酰基肉碱在同侧黑质中的丰度上调，而黑质是帕金森病（Parkinson’s disease, PD）主要的受累区域［56］，表明借助空间分辨代谢组学开展TBI和PD的诊治研究是很有前途的策略。

2.3 空间分辨代谢组学在糖尿病及其并发症上的应用

糖尿病（diabetes mellitus, DM）是一类以高血糖为特征的代谢性疾病，会导致失明、肾衰竭、心脏病发作、中风和下肢截肢等严重并发症。糖尿病及其并发症造成全球每年超过200万人死亡。因此，早预防早发现早管理是预防或延缓糖尿病发病诊治的关键。利用链脲佐菌素诱导大鼠发生I型糖尿病，干扰两周后取早期糖尿病大鼠模型肾脏进行空间分辨代谢组学分析，结果显示早期糖尿病大鼠多不饱和脂肪酸和单酰基甘油含量增加，部分短链和长链的酰基肉碱积累［57］。Miyamoto等［58］借助MALDI-MSI技术发现鞘磷脂大量积累促使ATP产生，导致糖尿病肾脏中肾小球三磷酸腺苷与单磷酸腺苷（ATP/AMP）比例增加，鞘磷脂可能是糖尿病诊治的潜在靶点。Wang等［18］对糖尿病肾病（DN）组织代谢物进行重新编码，利用AFADESI-MSI识别、可视化检测由高脂饮食喂养的链脲霉素（STZ）处理的DN鼠模型。以小鼠肾脏整体的代谢变化为观察指标，通过MALDI-MSI绘制出肾脏皮质中特异性代谢物的定位含量分布，观察到DN组大鼠的肾皮质、外延髓、间延髓明显不同于对照组大鼠的肾皮质、外延髓、间延髓，STZ诱导的糖尿病大鼠在这些区域发生了不同的代谢改变。Zhang等［59］通过比较不同方式诱导的DN大鼠模型，证实不同方式诱导下代谢物确实存在区域性差异。所以，利用空间分辨代谢组学可原位鉴别肾脏中病变组织与正常组织间的代谢异常及代谢紊乱的特点，为糖尿病肾病的诊断提供重要的辅助作用。Huo等［60］通过空间分辨代谢组学对糖尿病大鼠脑中的牛磺酸、抗坏血酸、组氨酸等代谢产物进行定位、定性和相对定量分析发现，糖尿病脑病（DE）大鼠的脂质代谢在特定区域发生紊乱以及存在差异代谢物。Meng等［61］利用AFADESIMSI技术检测到DE大鼠大脑皮层、海马体和杏仁核中的脂肪醛（FALs）存在特异性分布和富集情况，是导致DE认知功能缺陷的可能原因，为找到诊断糖尿病脑病的新型特异性生物标志物以及对厘清DE潜在发病机制提供了新见解。

2.4 空间分辨代谢组学在其他疾病上的应用

空间分辨代谢组学也被应用在其他疾病的诊治中（表3）。例如，Tans综述了质谱成像技术与高空间分辨率代谢组学研究传染病的发病机制［62］，为高危人群传染病的早期发现与诊断提供了新思路。Fincher等［63］基于硅纳米柱阵列的激光解吸电离质谱成像平台（NAPA-LDI-MSI）对化脓性汗腺炎（HS）病人的皮肤组织与健康人类皮肤组织进行原位检测和无标记分子成像发现，HS病人皮肤组织中的中性脂质成分（如半乳糖基-/乳糖基神经酰胺、甘油三酯等）表达更为显著，以此区分HS病患和健康人群。空间分辨代谢组学也为乙型肝炎感染发病机制研究提供了新方向，例如，Park等［64］利用MALDI-MSI技术建立乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）急性感染期的小鼠模型发现，HBV感染小鼠中磷脂酰胆碱（PC）组成和表达变化可作为乙肝感染早期诊断的潜在标志物。动脉粥样硬化是由脂质和炎症诱发的动脉疾病，其特征是血管壁中斑块逐渐累积形成血栓致使心脏或大脑缺血。通过MALDI-MSI可视化人颈动脉斑块脂质异质性，有助于预防和诊治动脉粥样硬化疾病。另外，非靶向空间分辨代谢组学用于分析人类口腔的唾液成分，绘制出唾液中代谢产物特定的空间分布网络［65］，通过可视化检测不同口腔疾病的代谢产物变化，关联代谢产物与口腔疾病诊断。

表3 空间分辨代谢组学在疾病诊断中的应用Table 3 Applications of spatially resolved metabolomics in disease diagnosis

3 空间分辨代谢组学应用的挑战

基于质谱成像技术的空间分辨代谢组学，通过高空间分辨率定性定量分析组织或器官中代谢物的分布，得到疾病相关的分子数据，并根据代谢物含量和特征分布，分析疾病分类分型、诊治及制定预后策略。但该技术在很大程度上受样品收集、制备、存储，空间分辨率，仪器灵敏度，以及数据统筹处理的影响，因此限制甚至阻碍了其在临床上的推广应用。

3.1 样品收集、制备与保存

利用MSI技术的空间分辨代谢组学研究实验中，样品的收集与制备至关重要［86］，是实现高分辨成像的关键。传统代谢组学一般以血液、尿液、组织、粪便等为样本，取样后进行匀浆处理，几乎完全掩盖了样本异质性的代谢物信息［87］。经过基质包埋处理的新鲜组织样本切片或者冷冻组织切片采用拉伸法在两个方向上均匀拉伸用封口膜固定在载玻片上［88］，然后直接进行组织切片的质谱成像扫描。样本收集、制备过程的最大挑战之一是确保经MSI映射的分子空间位置与生物组织的结构区域和功能区域的特异性分布一致［89］。即要求样品收集、制备、处理过程必需足够快，防止生物分子降解和离域，保证样品中物质的完整性、不丢失其空间信息［90］。因此，生物样品采集后须及时制成基质包埋的新鲜组织切片，在冷冻条件下存储，以保持样品的原组织形态，降低生物分子内源性酶蛋白的水解，减缓生物分子氧化以及防止细胞、组织或器官中代谢物变化或离域。一般取到组织后，从开始包埋到放入-80℃冰箱的时间，需要控制在5 min内。尽量避免样品破裂，或由于组织中不同部分以不同的速度冷却，形成冰晶而使样品损坏。福尔马林浸泡、石蜡包埋、HE染色、荧光标记等处理过的样本不适合空间分辨代谢组学分析，也不建议用PBS或者生理盐水浸泡样本［91］，因为基质的添加容易造成被测物质空间位移、低分子量代谢物受干扰和重复性差等问题，同时阻碍MSI中分子解吸和电离。此外，制备过程中因样本类型不同和采用检测离子源不同，在收集、制备和存储环节的复杂性也各不相同。因此，选取合适的方法才能使样品更好地满足MSI技术分析。

3.2 空间分辨率、检测灵敏度和成像速率

空间分辨率越高，成像谱图越精细，更易发现差异代谢物，更好揭示组织代谢的异质性。因此，提高空间分辨率是实现高分辨质谱分析和得到精细准确的代谢物信息的关键。空间分辨率与离子源检测的单位离子化面积大小相关，电离面积越小，分辨率越高，故提高空间分辨率需要减小采样的离子束或激光束直径。但是随着离子化面积的减小，离子产量也会下降，即可用分子量随之减少，后果是造成检测灵敏度降低和成像速率减慢。因此，灵敏度也是高分辨率成像的重要因素。开发新的超灵敏检测器或提高离子产量是解决灵敏度问题的手段。Bookmeyer等［92］为改善量测脂质类代谢物时所产生的离子抑制效应，在MALDI-MSI的基础上增加了单光子诱导化学电离（single-photon-induced chemical ionization, SPICI），能将代谢物的信号强度提高了3个数量级，并且降低了正离子模式下的背景干扰，是高效准确代谢物的低成本检测的新方法。俘获离子迁移谱（TIMS）与MALDI-MSI结合技术大大提升了脂质类代谢物检测的信噪比［93］。Mou等［94］提出的基于纳米分辨质谱显微成像技术，清晰区分细胞中细胞膜、细胞质和细胞核中的物质分布，捕捉单细胞中的差异性代谢物，有期望成为空间单细胞代谢组学分析的实用工具。另一方面，成像时间随着高分辨率呈指数增长。TOF-SIMS imaging是目前成像最快的技术，每秒可达50 000像素，而MALDIMSI成像速度通常低于40像素/s。成像速率越慢，分析时间越长，样品分析效率就越低［5］。现阶段既要求MSI技术具有高空间分辨率又不损失灵敏度和成像速率，还能对低丰度的代谢产物进行高覆盖成像分析，是存在一定难度的，也是该技术发展必需面对和改进的关键问题。

3.3 定量分析能力

虽然MSI技术拥有出色的代谢物定性能力，但由于存在离子抑制效应、基质效应、电离效率不均、缺乏标准、样品异质性和表面形态起伏等问题，使得代谢物的准确定量并不容易。目前，MSI技术是通常采用样本内标或参照选定的内源性分子的含量，通过MSI信号强度进行数学换算来获取其他样本分子的相对定量策略。该方法分析步骤复杂，也易受样本自身差异的干扰，会影响定量结果的准确性和精确性。虽然采取总离子流归一化处理方法以提高定量的准确性［95］，但并不能很好地降低基质效应带来的偏差。Lewis等［96］利用同位素标记内标法在一定程度上规避了基质效应的影响，但很难确定样本中的内标分布的均匀性。因此，发展绝对定量的MSI技术（QMSI）［97］是提升和推广MSI技术应用的重要研究方向。

3.4 数据存储、管理与分析处理

相较于传统代谢组学方法，MSI在代谢物信息提取、整合、数据处理及精准定性分子类型等方面都取得了一定程度的提升和发展。但它不可避免地产生高度复杂的多维数据集，如数据量高达数TB，还要求对高分辨率数据进行高效快速处理和智能存储，使得空间分辨代谢组学实际操作变得更加困难，需要更复杂的算法［98-99］。解决这些需求大大地超过了目前的技术能力。解读高维数据、分析出所对应的空间异质性，还需要具备扎实的专业综合知识，数据分析过程耗时耗力，所以，降维处理、分析数据是至关重要的［100］。同时，解释样本中检测的差异和确定样本间或样本内空间分布是否存在差异性，需要对大型成像数据集进行统计分析，如主成分分析、层次聚类分析和偏最小二乘判别分析等，判断结果是否具有实际意义，也尤为重要。最后，空间分辨代谢组学所面临的一个巨大挑战是需要选择先进的方法有效整合不同模式的数据，消除使用不同平台以及软件处理分析数据时产生的差异性结果［101］，更好地服务于疾病的诊断治疗应用。Rappez等［102］和Yuan等［103］分别建立了SpaceM、SEAM平台，供以解决空间分辨代谢组学产生的数据分析难题。一些开源工具包的开发与应用，也为空间分辨代谢组学数据的深层解析提供了便利［39］。

4 总结与展望

空间分辨代谢组学不仅具有质谱成像技术高灵敏度、高分辨率、便于可视化表达等优点，还能够对代谢物进行直接原位定性、定量、定位分析。通过代谢物在病理组织中的空间分布异质性，筛选出疾病相关的特异性生物标志物，为疾病的诊疗提供一定的辅助诊断作用。此外，空间分辨代谢组学技术的高灵敏度、高分辨率、高通量分析能力等特点使其在药物筛选以及疗效观察等领域具有较好的应用前景。目前，空间分辨代谢组学仍处于早期发展阶段，需要更贴合MSI的样本收集、存储与制备方法，空间分辨率和检测灵敏度相制衡的技术以及优化的数据处理和存储平台，建立机体中的完整代谢途径图谱。相信随着MSI技术的发展和代谢组学的不断完善、优化，获得的代谢物信息将具有更好的准确性、特异性和系统性，有助于加深理解代谢产物的含量、结构和空间分布以及其在疾病发生发展中的影响机制。空间代谢组学必将成为人类更高效、准确诊断疾病的一种有力手段，在推动精准医学和个性化诊疗方面发挥更大的作用。