bHLH96的克隆及其在薄荷萜烯生物合成调控中的功能

王斌 袁晓，2 蒋园园 王玉昆 肖艳辉 何金明

（1. 韶关学院生物与农业学院 广东省粤北食药资源利用与保护重点实验室，韶关 512005；2. 华南农业大学园艺学院，广州 510642）

萜烯类化合物是植物中种类最多的次生代谢产物，几乎存在于所有植物中，具有广泛的药理活性，例如抗炎、抑菌杀菌、抗疟疾和抑制肿瘤等活性［1］，但植物体内萜烯类物质含量低是普遍存在的问题。因此，通过基因工程的方法调控萜烯类化合物的生物合成，提高含量或改良萜烯组成，改良植物种质资源，对于增强萜烯类化合物的药理活性具有重要意义。唇形科（Labiatae）植物广泛分布于中国各地，是我国常用的传统中药材之一，在全球范围内已记录的唇形科植物有200余属和3 500余种［2］。

薄荷（Mentha haplocalyx Briq.）是唇形科薄荷属植物，是一种具有很高经济价值的芳香植物［3］。薄荷自1977年载入《中国药典》后一直收载至今，具有提高人体细胞渗透性、改善精神疲劳、消炎、祛痰以及促进术后排气等多种作用［4］。薄荷还可与牛蒡子、连翘、金银花等草药配伍，以治疗风热感冒或温病初起；与白芷石膏、川芎等配伍，可用于治疗风热上攻，如头晕和眼花；与当归、白芍、柴胡等草药组合，对治疗肝气郁结有较好疗效［5］。

根据分子结构中含有的异戊二烯单元数，萜烯可细分为单萜、倍半萜、二萜、二倍半萜、三萜、四萜、多萜。尽管部分植物如迷迭香、红豆杉等植物中的二萜和三萜含量也比较高，但大部分植物中的萜类物质主要以单萜和倍半萜化合物为主，其他类型萜的种类和含量相对较少［6-8］。植物萜烯合成均起始于2个C5异戊二烯单元的前体物质，即异戊烯基焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate, IPP）和3,3-二甲基丙烯基焦磷酸（dimethylallyl pyrophosphate,DMAPP）［9］。IPP和DMAPP在细胞质中由甲羟戊酸（mevalonate pathway, MVA）途径合成，在质体中由2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate, MEP）途径合成［1］。细胞质中主要负责倍半萜和三萜等的生物合成，质体中主要负责单萜和二萜等的合成［10］。但植物萜烯的生物合成是一个极度复杂的过程，萜烯的合成速率和流向还受到萜烯合成酶（terpene synthase, TPS）的直接调控，而TPS表达则直接受转录因子等反式作用因子的调控。

转录因子是一类可直接调控基因表达的反式作用因子，研究表明，TPS表达受许多转录因子的调控。如番茄中SCL（scarecrow-like）家族转录因子SlSCL3通过激活相关TPS的表达，正向调控多种挥发性萜的合成［11］。柑橘CitERF71转录因子通过激活CiTPS16表达，从而调控甜橙香叶醇的合成和释放［12］。作为最大的转录因子家族之一，bHLH在调控植物萜烯合成中具有重要作用［13-14］。拟南芥bHLH家族转录因子AtMYC2直接与AtTPS21和AtTPS11的启动子结合，激活其表达并促进倍半萜的合成［15］。黄花蒿AabHLH1能直接与AaADS和AaCYP71AV1启动子中的E-box顺式元件结合，促进青蒿素的生物合成［16］。但bHLH转录因子家族基因是否参与薄荷萜烯的生物合成，以及其具体调控哪些萜烯组分的合成，国内外少有相关研究报道。

薄荷地上部组织中含有种类和含量丰富的萜烯化合物，尤其以叶片中的萜烯含量最高。在分析前期转录组数据时，鉴定了一个在薄荷叶片中高表达的bHLH转录因子基因，命名为bHLH96。

本研究从薄荷叶片中克隆出了bHLH96全长序列，分析亚细胞定位和序列特性，并在叶片中分析瞬时过表达对薄荷TPS表达与萜烯含量的影响，为通过代谢或基因工程改良薄荷种质提供重要基因资源，拓展有关植物挥发性次生代谢产物合成途径与调控机制的认识。

1 材料与方法

1.1 材料

供试薄荷品种为‘恒进高油’，种植于韶关学院生态园芳香植物基地，通过扦插方式无性繁殖。将薄荷茎秆用无菌剪刀剪成长度为5 cm左右的小段，用1∶800的多菌灵溶液浸泡消毒处理薄荷茎段5 min，扦插在混合育苗基质（草炭土∶蛭石=1∶1）上待生根发芽。分别在2020年和2021年3-4月份育苗，当扦插的薄荷小苗生长至10 cm高度时开展后续试验。

1.2 方法

1.2.1 薄荷叶片和茎的转录组测序 扦插生根的薄荷幼苗长至20 cm时，将叶片和茎组织单独收集，用于转录组测序分析。将来自于6株植株的新鲜茎和叶片分开收集在50 mL的离心管中（3个重复，各重复单独取样），液氮速冻，-80℃保存。转录组测序由北京百迈客生物科技有限公司进行。

使用天根生化科技（北京）有限公司的总RNA提取试剂盒（产品编号：DP441）提取总RNA。用琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的纯度和完整性，利用上海翌圣生物科技有限公司的反转录试剂盒（产品编号：11141ES）合成cDNA。cDNA文库构建、转录组测序、基因功能注释等步骤详见文献［17］。

测序完成后，将测序结果推送至百迈客云（https://www.biocloud.net/），利用该云平台分析转录组测序数据。差异表达基因的筛选标准为：差异倍数（fold change, FC）≥2.0，q值≤0.01。使用FPKM（fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments）值表示基因表达水平［17］，利用TBtools软件根据FPKM值绘制薄荷叶片和茎中差异表达的bHLH家族基因的表达热图。

1.2.2 bHLH96全长序列的克隆 根据转录组测序组装的序列预测编码区序列（coding sequence, CDS），利用NCBI在线工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast）设计全长特异引物（表1）。以叶片cDNA为模板，使用生工生物工程（上海）股份有限公司的2×高保真PCR Mix（产品编号：B639292）扩增bHLH96全长序列。反应体系：25 μL的2×高保真PCR Mix预混液、正反向引物各2 μL、2 μL的cDNA溶液和19 μL ddH2O。PCR扩增条件：95℃ 3 min；95℃ 15 s，58℃ 15 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 5 min。当反应至33个循环时，在每个反应体系中加入10 μL的普通Taq PCR Mix 预混液（产品编号：B639295），在PCR产物末端加A尾，以使PCR产物能与T载连接。

表1 引物信息Table 1 Primer information

PCR产物经凝胶电泳后回收，与pUCm-T载体连接，构建克隆重组载体，转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆进行测序。

1.2.3 亚细胞定位 使用BamH I内切酶将pBI121-GFP载体线性化。将bHLH96全长序列（不含终止密码子）正向插入到pBI121-GFP载体的BamH I酶切位点处，构建含GFP报道蛋白的亚细胞定位重组载体，由CaMV35S启动子驱动bHLH96表达，引物信息见表1。重组质粒转化DH5α感受态细胞，扩繁重组质粒，经测序验证后转化GV3101农杆菌感受态。之后使用真空渗透法将阳性单克隆农杆菌打入本氏烟草叶片，试验用本氏烟草为转mCherry蛋白的转基因烟草。共培养48 h后，使用正置荧光显微镜（德国蔡司，型号：Axio Imager Z2）观察转基因烟草叶片细胞中的mCherry和GFP荧光。

1.2.4 氨基酸序列特性分析 将bHLH96蛋白序列提交至NCBI数据库中blast，比对得到与该蛋白同源性高的候选蛋白。在候选蛋白中挑选与bHLH96蛋白同源性高的4种模式植物（野生稻、拟南芥、烟草和番茄）的bHLH96蛋白序列，利用DNAMAN v6软件的多序列比对功能绘制氨基酸序列比对图片。

在PlantTFDB网站（http://planttfdb.gao-lab.org/index_ext.php）下载拟南芥bHLH家族基因的氨基酸序列，鉴定出与薄荷bHLH96蛋白亲缘性最高的拟南芥bHLH蛋白。在NCBI数据库中查找唇形科植物bHLH家族蛋白，利用获得的氨基酸序列，使用MEGA7软件中的邻接法（neighbor joining, NJ）进行系统发育分析。MEGA7软件中bootstrap值设置为1 000次，其余参数均为软件默认。根据bootstrap值将植物bHLH蛋白划分为不同亚类，亚类分组的阈值为50次。利用WebLogo网站（http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）分析bHLH蛋白保守结构域的保守性。

1.2.5 荧光定量PCR（RT-qPCR）分析 使用美国Bio-Rad公司的RT-qPCR仪（型号：CFX Connect）分析基因表达情况，RT-qPCR反应体系：cDNA溶液1 μL、正反向引物各1 μL、PCR mix 10 μL和ddH2O 7 μL。反应程序：95℃ 5 min；95℃ 10 s，58℃ 20 s，72℃ 20 s，40个循环。在反应的最后增加溶解曲线，按照仪器默认参数增加溶解曲线。以薄荷Actin（NCBI登录号：KR082011.1）为内参基因，通过2-△△Ct法根据Ct值计算特定基因的表达量［17］。

1.2.6 薄荷叶片中瞬时过表达bHLH96 将bHLH96全长序列正向插入到pBI121-GUS载体的BamH I酶切位点处构建重组pBI121-bHLH96。利用真空渗透法将含重组质粒（OE）和pBI121空载质粒（CK）的GV3101农杆菌分别侵染薄荷叶片，在薄荷叶片中瞬时过表达bHLH96。每处理各使用6株幼苗（约20 cm）用于瞬时过表达分析，每株薄荷选取3-4片幼嫩叶片用于注射农杆菌（老叶细胞壁较厚，农杆菌渗透液不易渗入）。薄荷叶片注射了农杆菌后，在黑暗环境下培养24 h，之后转移至光周期为16/8 h（光/暗）、温度为25℃的环境中继续生长。在7 d时收集叶片，检测挥发性化合物含量和TPS表达的变化。通过顶空固相微萃取法（GC-MS型号：7890B-5977B，安捷伦科技公司）检测薄荷叶片中挥发性化合物的种类及含量。

1.2.7 数据分析 在Excel 2016软件中汇总整理试验数据，并绘制柱形图以及分析数据间的相关性。使用SPSS 22软件中的Student's t-test法检验2组样品间的差异显著性（P≤0.05），各处理或组织包含3个独立的生物学重复。

2 结果

2.1 薄荷bHLH基因在不同组织中的表达

通过比较分析叶片和茎的转录组学差异，共鉴定到21个bHLH基因在叶片和茎中差异表达。其中，仅bHLH7、bHLH87和bHLH96在叶片中高表达，另外18个bHLH基因在茎中高表达（图1-A）。推测3个在叶片中高表达的bHLH基因可能正向调控萜烯的生物合成，本研究重点探究bHLH96在薄荷萜烯合成中的调控作用。

图1 薄荷bHLH家族基因的表达模式及bHLH96的表达Fig. 1 Expression patterns of bHLH family genes and bHLH96 expression

转录组测序分析结果显示，叶片中bHLH96表达量比茎中的表达量高2.59倍（图1-B）。为验证转录组测序结果的可靠性，采用RT-qPCR法检测根、茎和叶片中bHLH96的表达情况（图1-C），bHLH96在根中的表达量最低，在叶片中的表达量最高，在叶片中的表达量比茎中高3.34倍，总体与转录组结果一致。尽管bHLH96在薄荷不同组织中组成型表达，其表达模式表现出明显的组织特异性，且在叶片中显著高表达，这与挥发性萜烯化合物主要在叶片中合成积累的特性是一致的。初步表明薄荷bHLH96表达与萜烯化合物的含量正相关，可能参与薄荷萜烯类化合物的合成调控。

2.2 薄荷bHLH96全长的克隆

转录组测序组装的薄荷bHLH96全长包含861 bp。以薄荷叶片cDNA为模板，通过RT-PCR法扩增bHLH96全长序列。结果显示，在750-1 000 bp间有一条DNA条带（图2-A），DNA片段大小符合预期。菌落PCR结果（图2-B）表明，成功获得转化重组质粒的阳性单克隆菌落。经测序，获得薄荷bHLH96的核苷酸序列，推导其氨基酸序列（图3）。

图2 薄荷bHLH96的PCR扩增产物电泳图Fig. 2 Electrophoresis maps of PCR amplification products of peppermint bHLH96 gene

图3 薄荷bHLH96的核苷酸序列（浅绿色背景）和推导的氨基酸序列（浅蓝色背景）Fig. 3 Nucleotide sequence（light green background）and the deduced amino acid sequence（light blue background）of peppermint bHLH96 gene

2.3 薄荷bHLH96蛋白的亚细胞定位

mCherry蛋白具有核定位信号［18］。通过观察mCherry和GFP蛋白的定位发现，pBI121空载的mCherry蛋白定位在细胞核，GFP蛋白定位在细胞质。但在bHLH96-GFP重组质粒中，mCherry和GFP蛋白均定位在细胞核（图4）。表明bHLH96是一个核定位蛋白，符合转录因子定位在细胞核、在细胞核中发挥转录调控作用的特性。

图4 薄荷bHLH96转录因子的亚细胞定位Fig. 4 Subcellular localization of peppermint bHLH96 transcription factor

2.4 薄荷bHLH96氨基酸多序列比对和系统发育分析

为分析薄荷bHLH96蛋白的功能保守性，比较其与4种模式植物（野生水稻、拟南芥、烟草和番茄）bHLH96蛋白的氨基酸序列相似性。5种植物的bHLH96蛋白序列中均含有一个bHLH保守结构域（图5-A），且保守结构域的保守性很高（图5-B）。薄荷bHLH96蛋白的氨基酸序列与烟草bHLH96和番茄bHLH96的同源性最高，分别为55.74%和52.73%，与野生水稻和拟南芥bHLH96的氨基酸序列一致性均低于50%。番茄bHLH96与烟草bHLH96蛋白的氨基酸序列一致性最高，为73.68%（表2）。这是因为番茄和烟草同属于茄科植物，亲缘关系更近，序列相似性也更高。薄荷bHLH96与4种模式植物的氨基酸序列相似性较低，意味着bHLH96在植物中具有复杂多样的生物学功能，bHLH96在薄荷中的生物学功能可能有别于拟南芥等模式植物。

图5 薄荷bHLH96与模式植物bHLH96氨基酸序列比对（A）和保守结构域保守性分析（B）Fig. 5 Amino acid sequence alignment（A）and conservation analysis of conserved domain（B）of peppermint bHLH96 and bHLH96 from model plants

表2 不同植物bHLH96氨基酸序列一致性比较Table 2 Comparison in the amino acid sequences of bHLH96 proteins in different plant species%

在拟南芥bHLH家族中，AtbHLH96（登录号：AT1G72210.1）和AtbHLH94（登录号：AT1G22490.1）与薄荷MbbHLH96蛋白的亲缘关系最近。唇形科植物以富含萜烯化合物而著称［19］。为从系统发育角度证明薄荷bHLH96参与萜烯合成调控，利用拟南芥AtbHLH96和AtbHLH94的氨基酸序列，以及唇形科植物bHLH家族蛋白的氨基酸序列进行了系统发育分析。

根据bootstrap值可将植物bHLH蛋白划分为2个亚类（图6）。其中，薄荷MhbHLH96与同属于唇形科的鼠尾草（Salvia hispanica）ShbHLH96、丹参（Salvia miltiorrhiza）SmbHLH94、薰衣草（Lavandula angustifolia）LaMYC4等bHLH蛋白，以及拟南芥AtbHLH96和AtbHLH94聚在同一分支，丹参SmbHLH10与SmbHLH148聚在另一分支。说明薄荷bHLH96与薰衣草LaMYC4的亲缘关系较近，可能与LaMYC4具有相似的生物学功能。

图6 植物bHLH蛋白系统发育分析Fig. 6 Phylogenetic analysis of plant bHLH proteins

2.5 过表达薄荷bHLH96对叶片萜烯含量的影响

为探究bHLH96是否会影响萜烯化合物的合成，在薄荷叶片中瞬时过表达bHLH96，研究过表达bHLH96对薄荷萜烯含量的影响。与只过表达空载pBI121的对照（CK）相比，过表达bHLH96尽管没有显著影响薄荷醇（menthol）等薄荷特征性挥发性组分的相对含量，但显著影响15种萜烯化合物的相对含量（表3）。其中，OE中11种挥发性化合物的含量显著高于CK，4种挥发性化合物的含量显著低于CK。对降低（±）-薄荷酮［（±）-pulegone］含量的作用最明显，表明bHLH96影响薄荷萜烯化合物的合成。

表3 CK和OE薄荷叶片中的挥发性化合物种类和相对含量Table 3 Types and relative contents of volatile compounds in the leaves of CK and OE peppermint seedlings

2.6 过表达薄荷bHLH96对萜烯合成相关基因表达的影响

由于过表达bHLH96显著影响薄荷萜烯化合物的相对含量，为此分析过表达bHLH96对TPS相关基因表达的影响。在OE样品中，bHLH96表达量显著高于CK（图7-A），表明bHLH96在薄荷叶片中成功过表达，OE样品中其他基因表达发生变化是由bHLH96表达增加引起的。瞬时过表达bHLH96显著上调5个TPS的表达，分别是2,3-氧化鲨烯环化酶基因OC2（2,3-oxidosqualene cyclase 2）、角鲨烯单加氧酶基因SM1（squalene monooxygenase 1）、贝壳杉烯合成酶基因KS1（kaurene synthase 1）、（+）-新薄荷醇脱氢酶基因ND［（+）-neomenthol dehydrogenase］和内根-贝壳杉烯酸氧化酶基因EAO1（ent-kaurenoic acid oxidase 1）；显著下调3个TPS基因的表达，依次是橙花叔醇/芳樟醇合酶基因NLS1（nerolidol/linalool synthase 1）、异薄荷二烯酮还原酶基因iPR［（-）-isopiperitenone reductase］和柠檬烯合成酶基因LS（limonene synthase）（图7-B-I）。表明转录因子bHLH96通过影响TPS基因相关基因的表达，控制萜合成速率和流向，从而调控萜烯类化合物的生物合成。

图7 薄荷叶片中瞬时过表达bHLH96对相关TPS基因表达的影响Fig. 7 Effects of transient overexpression of bHLH96 in the peppermint leaves on the expressions of TPS genes

2.7 可能受bHLH96调控的TPS基因表达与萜烯含量的相关性分析

为明确过表达bHLH96导致15种萜烯含量发生变化是否由相关TPS基因表达量改变引起，分析TPS基因表达与萜烯含量的相关性。15种萜烯物质的含量与8个TPS基因的表达量间具有明显相关性（附表1），且相关性很高，表明bHLH96过表达引起上述萜烯物质含量变化与TPS基因表达密切相关。对萜烯化合物含量而言，bHLH96表达与（E）-2-已烯醛［（E）-2-Hexenal］含量的正相关性最高（R2=0.98），与异胡薄荷醇（isopulegol）含量的负相关性最高（R2=-0.99）。对TPS基因表达而言，bHLH96表达与SM1和KS1表达的正相关性最高（R2=1.00），与iPR表达的负相关性最高（R2=-0.98）。说明bHLH96可能正向调控与其表达呈正相关性的TPS基因，负向调控与其表达呈负相关性的TPS基因，也再次证实一些萜烯含量发生变化是由bHLH96表达量增加引起。

3 讨论

bHLH转录因子是植物最大的转录因子家族之一，在植物生长发育、信号转导、逆境胁迫反应和次生代谢产物合成调控中具有重要作用［21-23］。植物精油主要在腺毛（trichome）中合成并贮存，而腺毛主要在叶表皮形成并分泌，尽管茎中也含有少量腺毛，但数量甚微［24-25］，暗示着在叶片中高表达的bHLH基因可能调控萜烯物质的生物合成。比较转录组学分析或许能鉴定到一些调控萜烯合成的关键bHLH家族基因。为此，本研究利用比较转录组学分析了bHLH基因家族在薄荷不同组织中的表达模式发现，薄荷bHLH96在叶片中的表达量显著高于茎中的表达量，RT-qPCR结果也证实bHLH96在叶片中的表达量最高，推测bHLH96可能参与薄荷萜烯化合物的生物合成调控。薄荷是热带、亚热带地区重要的经济作物，茎叶通常用于提取精油或作为中草药，具有很高的经济价值和药用价值［26］。但由于品种杂合度高，无性繁殖体细胞容易变异，使得不同品种间的薄荷精油组分差异很大，直接影响精油质量和药用价值。因此，克隆bHLH96并探究其在薄荷萜烯化合物合成中的调控作用，对于丰富bHLH基因家族的生物学功能具有重要意义，能为薄荷遗传改良提供重要候选基因。

本研究从薄荷叶片中克隆到了bHLH96的全长序列，其编码含有286个氨基酸的蛋白质。氨基酸多序列比对结果显示，本研究所比对植物bHLH96蛋白的氨基酸序列中均含有一个bHLH保守结构域，表明薄荷bHLH96属于植物bHLH转录因子超级家族中的一员。植物bHLH96蛋白的保守结构域保守性很高，但保守结构域外的其他序列存在较大差异，反映在不同植物bHLH96蛋白的氨基酸序列一致性相对较低，这可能是不同植物面对的生长环境和气候条件存在较大差异的原因。植物面对复杂多变的生长环境和生物与非生物胁迫，可能导致保守结构域外的其他序列发生了一定程度的突变，以适应环境变化。薄荷bHLH96定位在细胞核，与其他植物bHLH蛋白定位在细胞核的特性一致［27-29］，表明薄荷bHLH96在细胞核中发挥转录调控作用。薄荷bHLH96与薰衣草LaMYC4等唇形科植物bHLH家族蛋白聚在一个分支，亲缘关系很近。LaMYC4被证实直接调控薰衣草中萜烯的生物合成［20］，说明薄荷bHLH96与LaMYC4具有相似的生物学功能，其可能在薄荷萜烯合成调控中具有重要作用。

许多研究表明，植物bHLH家族转录因子参与次生代谢产物的合成调控，MYC类转录因子是研究最多的bHLH转录因子［14］。拟南芥AtMYC2是一个bHLH家族转录因子，在拟南芥中过量表达AtMYC2可显著增加腺毛数目，进而促进腺毛中萜烯类物质的合成［30］。长春花CrMYC1和CrMYC2能与异胡豆苷合成酶（strictosidine synthase, STR）基因启动子序列的G-box元件结合，直接调控长春花中萜类吲哚生物碱的生物合成［31］。在紫杉中也鉴定到了1个MYC转录因子，能与二萜紫杉醇合成途径中紫杉二烯合酶（taxadiene synthase, TS）基因的启动子结合，调控靶基因的表达［32］。本研究中，在薄荷叶片中瞬时过表达bHLH96显著增加11种萜烯化合物的含量，降低4种萜烯含量，显著上调5个TPS基因的表达，下调3个TPS基因的表达，且受bHLH96影响的TPS基因的表达与萜烯的含量呈明显相关性，证明bHLH96调控薄荷萜烯化合物的生物合成。

植物萜烯合成速率和流向直接受萜烯合成酶的控制［33］，KS和EAO参与植物二萜类物质的合成调控。KS催化柯巴基焦磷酸（ent-copalyl diphosphate）生成贝壳杉烯［34］。EAO可催化内根-贝壳杉烯酸向GA前体转化，GA是典型的二萜类物质［35］。OC是三萜化合物生物合成的关键酶，能将柔性的线性底物精准地催化环化生成不同骨架结构的三萜产物［36］。本研究中，在薄荷叶片中瞬时过表达bHLH96显著上调OC2、KS1和EAO1等二萜和三萜合成基因的表达，表明bHLH96正向调控二萜和三萜化合物的合成。NLS、iPR和LS等萜烯合成酶是控制薄荷单萜合成的关键酶［37］。ND是一种单萜脱氢酶，参与（+）-新薄荷醇等单萜的合成［38］。本研究中，过表达bHLH96显著下调单萜合成酶基因iPR、LS和NLS1的表达，却上调ND1的表达；降低异胡薄荷醇和（±）-薄荷酮等单萜的含量，提高己醛（hexanal）和α-蒎烯（α-pinene）等单萜物质的含量，表明bHLH96复杂地调控薄荷单萜类物质的合成。结果表明，薄荷bHLHL96通过调控TPS基因的表达，控制萜烯合成流向。因此，通过在薄荷中调控bHLH96表达，能丰富薄荷挥发性萜烯物质的种类和相对含量，改善薄荷精油中萜烯类化合物组分，从而改良薄荷的药用价值。但bHLH96是如何调控这些TPS基因的表达的，尚需通过酵母单杂、双荧光素酶报道基因实验等分子生物学研究手段进一步明确。

4 结论

薄荷bHLH96属于植物bHLH转录因子超级家族，是一个核定位蛋白，可能在细胞核中发挥转录调控作用。植物bHLH96蛋白的保守结构域保守性很高，薄荷bHLH96与同属于唇形科的薰衣草LaMYC4的亲缘关系较近。在薄荷叶片中瞬时过表达bHLH96显著影响8个TPS基因的表达，影响15种萜烯化合物的相对含量，表明可能通过调控TPS基因表达，控制萜烯合成流向，从而调控萜烯物质的合成。

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