振荡频率对曼氏无针乌贼成体死亡率及生存状态的影响

周珊珊， 周永东， 李 哲， 欧阳洪， 镇小蔓，梁 君， 陈俊琳， 陈佳怡， 徐开达*

(1. 浙江省海洋水产研究所，浙江 舟山 316000；2. 浙江省海洋渔业资源可持续利用技术研究重点实验室，浙江 舟山 316000；3. 浙江省普陀区海洋与渔业局，浙江 舟山 316100)

曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)属软体动物门(Mollusca)头足纲(Cephalopoda)十腕总目(Decapodiformes)乌贼目(Sepioidea)乌贼科(Sepiidae)，俗称墨鱼，属于中型乌贼，曾是我国“四大海产”之一，在我国浙江和福建沿海较为集中。过度捕捞和生境破坏等致使乌贼资源受到严重破坏，产量连续下降，曼氏无针乌贼已经无法形成渔汛，因此相关部门开展了一系列的增殖放流工作[1-4]。目前，曼氏无针乌贼增殖放流主要通过放流乌贼受精卵的方式开展，附着的乌贼卵易被海水冲散或因环境因素而不能完全孵化，孵化率低，放流幼体和怀卵亲体的方式可以提高乌贼卵的孵化率和幼体存活率[3,5-8]。然而，乌贼在运输过程中对外界刺激十分敏感，运输晃动容易使其喷墨而大量死亡，成为制约增殖放流、苗种繁育等过程的关键因素[9-10]。

运输过程中会发生水流的振荡，振荡程度可以通过振荡频率来量化[11-13]。振荡频率影响黑棘鲷(Acanthopagrus schlegelii)幼鱼、大口黑鲈(Micropterus salmoides)、石斑鱼、鲫(Carassius auratus)等鱼类的死亡率，且对乳酸、糖原、酶活性等具有显著影响，乳酸、糖原、酶活性等生理生化指标是反映机体能量代谢和应激情况的重要指标[11-14]。且谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(GOT)、碱性磷酸酶(ALP)、超氧化物歧化酶(SOD)活性与硫化物、亚硝酸氮对曼氏无针乌贼的胁迫损伤密切相关[15-16]。目前，国内外学者的研究主要集中在乌贼生态学[17-18]、人工繁育[19-21]、生长发育[22-24]、资源分布[25]、分子生物学[26-27]等方面，但仍缺乏运输过程中振荡频率对曼氏无针乌贼死亡率及生存状态影响的相关研究。因此，本研究选用乳酸、糖原及ALT、GOT、ALP、SOD的活性为指标开展了振荡频率对乌贼死亡及机体影响的研究，查明了振荡频率对乌贼成体死亡及生存状态的影响，推测高频率下曼氏无针乌贼成体的死亡原因，量化乌贼对振荡频率所产生的应激程度，为曼氏无针乌贼成体的增殖放流运输过程提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 实验材料及驯化

实验所用曼氏无针乌贼为成体，取自浙江省舟山市西轩养殖试验场中间培育的乌贼，胴背长为(6.5±0.3) cm，体重为(2.8±0.4) g，且各频率组间无显著差异(P＞0.05)。采用上海力辰仪器科技有限公司HY-4A调速多用振荡器(振荡幅度20 mm，频率0～300 r/min)进行实验。实验在西轩养殖场进行，暂养1周，每天定时 6∶00、17∶00投喂冰鲜饲料，饲喂后换水，用氧气泵不断向水中充氧，保持水中DO＞5.5 mg/L，盐度为30～31，pH 7.8～7.9，光照周期为12 L∶12 D。实验开始前24 h停止喂食，然后将乌贼从暂养池中转入到相同水温的透明聚乙烯圆形水桶(体积5 L)，将水桶平放于模拟运输振动台上并加以固定。实验过程中操作人员严格遵守实验动物福利和动物实验伦理规范，并按照浙江海洋水产研究所实验动物管理及动物福利伦理委员会制定的规章制度执行。

1.2 实验方法

参考相关文献[11-14]，并根据预实验结果，去除短时间内可能会导致乌贼高死亡率，无法进行实际运输操作的较大频率。共设 6个处理组，振荡频率分别为0、60、100、120、140、160 r/min，每个振荡设3个平行。实验持续12 h，各组水温均为 23 °C，保持DO＞5.5 mg/L，海水盐度、pH同暂养池，实验过程不投饵。每个透明聚乙烯圆形水桶内盛放2.5 L海水，放入4只乌贼。

实验过程中观察到乌贼浮于表面，鳍的摆动停止，触碰无反应即判定为死亡，记录对应时间，并捞出取样。当乌贼较虚弱的情况下，会出现喷墨情况，为避免喷墨产生的干扰，喷墨后轻柔换水。每组实验在该组全部样品死亡后结束，若该组样品未全部死亡则在实验进行 12 h 后终止。乌贼经丁香酚快速麻醉后，测量体长和体重，随后置于冰上快速取其腹部肌肉、肝脏样品，保存于–80 °C中待测。采用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定肝脏组织中的乳酸和糖元含量以及各酶的活性。

1.3 数据分析

数据的统计和分析采用SPSS 17.0软件进行，并以平均值±标准误(mean±SE)表示，采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)对乌贼胴背长、死亡率、糖原和乳酸含量、酶活性等数据进行差异分析，以P＜0.05作为差异显著标准。乌贼死亡率与生理指标间采用Spearman相关性分析，以P＜0.05作为显著相关标准，以P＜0.01作为差异极显著标准。同时，利用MINE算法分析各指标与死亡率间的相关性。

2 结果

2.1 不同振荡频率下曼氏无针乌贼的喷墨行为及死亡率

曼氏无针乌贼对振荡产生了一系列的适应性行为，低频率处理组乌贼静止匍匐于水槽底部，游动频率减少。高频率处理组(120、140、160 r/min)，部分乌贼静止匍匐于底部，部分乌贼会利用触腕，缠绕于气石水管上或贴于玻璃槽壁上(图版)。当乌贼较虚弱，无法控制墨囊肌肉时，会出现多次喷墨的情况，之后浮于水体表面，处于虚弱假死的状态，一段时间后死亡。

曼氏无针乌贼死亡时间主要出现在振荡4～8 h，频率越低出现死亡的时间越晚。高频率160 r/min在2 h时即出现死亡。对照组无死亡个体。60、100、120、140、160共5个处理组，在0～3的乌贼死亡数合计为4只，3～6 h死亡数合计为13只，6～9 h死亡数合计为10只，9～12 h死亡个数合计为6只(图1)。曼氏无针乌贼不宜长时间运输，振荡频率为60 r/min的运输时间不宜超过6 h，振荡频率为100 r/min的运输时间不宜超过3 h。

图1 不同频率下曼氏无针乌贼的死亡时间Fig. 1 Death time of S. japonica at different frequencies1. 1 h 12 min, 2. 2 h 24 min, 3. 3 h 36 min, 4. 4 h 48 min, 5. 6 h, 6. 7 h 12 min, 7. 8 h 24 min, 8. 9 h 36 min, 9. 10 h 48 min.

除160 r/min处理组外，随着频率增大，曼氏无针乌贼死亡率逐渐升高，频率120 r/min、140 r/min时死亡率最高，为91.7%，显著高于0、60和100 r/min处理组(P＜0.05) (图2)。

图2 不同振荡频率条件下曼氏无针乌贼的死亡率不同字母表示差异显著(P＜0.05)。Fig. 2 Death rates of S. japonica at different oscillation frequenciesDifferent letters indicate significant differences (P＜0.05).

图版 振荡情况下曼氏无针乌贼的行为过程1. 静止于水槽底部，2. 触腕吸附于水槽底部(箭头)，3. 触腕缠绕于塑料管(箭头)，4. 触腕缠绕于塑料管(腹面观，箭头)。Plate Behavior of S. japonica at different oscillation frequencies1. stationary at the bottom of the tank, 2. the tentacles adsorb to the bottom of the tank (arrow), 3. the tentacles wound around the pipe (arrow), 4. the tentacles wound around the pipe (ventral aspect, arrow).

2.2 不同振荡频率下曼氏无针乌贼糖原和乳酸含量变化

频率影响曼氏无针乌贼肌肉和消化腺糖原含量，不同组织糖原变化略有不同(图3)。随着频率的增加，肌肉糖原含量降低，对照组糖原含量最高(39.4 mg/g prot)，140 r/min处理组最低(26.0 mg/g prot)，其次为160 r/min处理组(29.1 mg/g prot)，140 r/min处理组与0、60和100 r/min间差异显著(P＜0.05)。除60 r/min处理组外，随着频率的增加，消化腺糖原含量降低，60 r/min处理组消化腺糖原含量最高(39.4 mg/g prot)，其次为对照组，160 r/min处理组糖原含量最低(26.8 mg/g prot)，100、140和160 r/min组与0 r/min组间差异显著(P＜0.05)。

图3 不同振荡频率条件下曼氏无针乌贼的糖原含量同一组织不同频率误差线上的不同字母表示不同振荡频率组间差异显著(P＜0.05)，图4同。Fig. 3 Glycogen content of S. japonica at different frequenciesDifferent letters above error bars indicate significant differences between different frequencies groups in same tissue (P＜0.05), the same as Fig.4.

频率影响曼氏无针乌贼肌肉和消化腺乳酸含量，随着频率的增加肌肉乳酸含量升高，对照组乳酸含量最低(0.8 mmol/g prot)，160 r/min处理组最高(1.3 mmol/g prot)，100、120、140和160 r/min组与0 r/min组间差异显著(P＜0.05)。除60 r/min处理组外，随着频率的增加，消化腺乳酸含量增加，0和100 r/min组乳酸含量最低，为 0.9 mmol/g prot，160 r/min处理组糖原含量最高(1.1 mmol/g prot)，60、160 r/min处理组与0 r/min组间差异显著(P＜0.05) (图4)。

图4 不同振荡频率条件下曼氏无针乌贼的乳酸含量Fig. 4 Lactic acid content of S. japonica at different frequencies

2.3 不同振荡频率下曼氏无针乌贼消化腺酶活性的变化情况

除60 r/min处理组外，随着频率的增加，ALT活性降低，120、140和160 r/min处理组与0、60和100 r/min处理组间差异显著(P＜0.05)，60 r/min处理组ALT活性最高(3.0 U/g prot)，160 r/min处理组ALT活性最低(1.5 U/g prot) (图5)。除60 r/min处理组外，随着频率的增加，GOT活性降低，120、140和160 r/min处理组GOT活性与0、60和100 r/min处理组间差异显著(P＜0.05)。在频率60 r/min下最高(4.3 U/g prot)，其次为对照组(3.9 U/g prot)，160 r/min最低(1.2 U/g prot) (图5)。

图5 不同振荡频率条件下曼氏无针乌贼的ALT和GOT活性同一种酶不同频率误差线上的不同字母表示不同频率组间差异显著(P＜0.05)，图7同。Fig. 5 Enzymatic activity of S. japonica at different frequenciesDifferent letters above error bars indicate significant differences between different frequencies group in same enzyme activity (P＜0.05).

ALP活性随着频率的增加而增加，0 r/min组最低(5.6 IU/g prot)，140 r/min组最高(7.9 IU/g prot)，140和160 r/min处理组与其他组间差异显著(P＜0.05)。除频率60 r/min处理组外，SOD活性随着频率的增加而升高，在频率60 r/min下最低(48.9 U/mg prot)，在140和160 r/min频率最高(66.5、66.4 U/mg prot)，且120、140和160 r/min处理组与其他组间差异显著(P＜0.05) (图6)。

图6 不同振荡频率条件下曼氏无针乌贼的ALP和SOD酶活性Fig. 6 Enzymatic activity of S. japonica at different frequencies

2.4 死亡率与生理指标相关性分析

不同振荡频率下，死亡率与SOD、肌肉乳酸含量、ALP之间呈极显著正相关(P＜0.01)，与肌肉糖原、消化腺糖原含量、GOT和ALT活性之间呈极显著负相关(P＜0.01) (表1)。

表1 死亡率与生理指标相关性分析Tab. 1 Correlation analysis of mortality and physiological indicators

不同振荡频率下死亡率与生理指标相关性较强的前5个生理指标依次为GOT活性、肌肉糖原含量、ALT活性、肌肉乳酸含量和SOD活性(表2)。

表2 MINE算法分析死亡率与生理指标的关系Tab. 2 MINE algorithm analying the relationship between mortality and physiological indicators

3 讨论

3.1 振荡频率对曼氏无针乌贼行为及死亡率的影响

运输过程中的晃动是引起水生动物死亡的重要非生物因素，特别对具有喷墨属性的博克氏蛸(Octopus bocki)、虎斑乌贼(Sepia pharaonis)等来说，喷墨引发较高的死亡率[10,28-30]。在遇到晃动时，曼氏无针乌贼采取静止匍匐于水槽底部的方式来对抗水流，当高频率晃动导致个体能量损耗，机体无法平衡匍匐于底部时，曼氏无针乌贼采取触腕缠绕于水管上或贴于玻璃槽壁上以辅助抵御水流的晃动。曼氏无针乌贼贴底匍匐和喷墨后的虚弱情况与虎斑乌贼喷墨后的情况基本一致[29]。振荡频率显著影响曼氏无针乌贼的死亡率，频率大于100 r/min时死亡率显著上升，在120和140 r/min频率下死亡率最高，且超过160 r/min频率下的死亡率，分析是由于容器发生了共振，增大了晃动程度。这与姜胜超[31]对波浪作用下液舱内流体晃荡的耦合数值分析研究相似，在舱外波浪与舱内液体共振时，舱内出现波峰变陡，波谷变坦的非线性特征，并在冲击顶盖后呈现出波浪翻卷及气液混合等复杂物理现象。因此，曼氏无针乌贼在运输过程中应尽量避免过高的振荡频率，特别是避免波峰重叠所造成的高死亡率的发生。

曼氏无针乌贼的死亡时间主要在4～8 h，频率越低个体出现死亡的时间越晚。黑棘鲷幼鱼在频率低于105 r/min振荡24 h的死亡率为0，在频率为140 r/min时死亡率为50%，175、210 r/min时死亡率100%[11]。与黑棘鲷幼鱼相比，在振荡12 h的情况下，乌贼在120、140 r/min时死亡率已经达到91.7%，相对于鱼类，其短时间内的死亡率更高。乌贼在100 r/min、运输12 h的死亡率为33.3%，当频率上升至120、140 r/min时，死亡率显著上升至91.6%。因此认为运输过程振荡频率宜低于100 r/min。根据运输实际，在振荡频率大于100 r/min情况下运输时间不宜超过2 h。

3.2 振荡频率对曼氏无针乌贼糖原、乳酸含量的影响

糖原主要存在于肌肉和肝脏中，有氧代谢途径分解代谢产生葡萄糖，而乳酸则是糖酵解途径的主要产物。随着振荡频率的增加，曼氏无针乌贼肌肉组织糖原逐渐耗尽，更多的供能来源于糖酵解途径，形成了乳酸堆积。在振荡频率为140 r/min时糖原含量最低，140和160 r/min时乳酸含量较高，这与大口黑鲈、黑棘鲷幼鱼、大黄鱼(Larimichthys crocea)等在运输振荡过程中糖原和乳酸的变化规律一致[11-12,32]。大口黑鲈在3 h，频率130 r/min的运输条件下，肌肉糖原含量显著低于0和60 r/min处理组，而乳酸含量显著高于0、60和100 r/min处理组。黑棘鲷幼鱼、大黄鱼随实验振荡频率的增加，肌肉乳酸浓度和糖元含量分别增加和降低。本研究中140 r/min处理组的糖原含量最低，与该组死亡率最高具有一致性。

乌贼的肝脏与肌肉组织中糖原和乳酸变化趋势基本一致，但在60 r/min出现了糖原增加、乳酸显著升高的趋势，说明乌贼在低频率的振荡下，启动了糖酵解途径为机体供能，引发了乳酸的堆积，之后肌肉中的乳酸通过血液运输至肝脏，在肝脏中重新合成了糖原，从而维持机体血糖稳定。因此，60 r/min情况下出现了糖原含量的增加和乳酸含量的显著升高，同时与肝脏解毒酶(ALT、GOT)活性小幅度的升高有一定相关性。当频率大于60 r/min，机体可能出现了肝脏损伤，肝脏的乳酸代谢能力降低，糖原的合成也相应降低。这与草鱼(Ctenopharyngodon idella)的肝脏糖原代谢有一定差异，脂肪蓄积对草鱼肝脏组织影响的相关研究发现，脂肪过量蓄积会导致肝脏内葡萄糖含量上升，乳酸含量下降，肝脏将乳酸合成为糖原为机体供能[33]。

3.3 振荡频率对曼氏无针乌贼酶活性的影响

ALT与GOT主要分布在肝细胞内。肝细胞发生病变或坏死时ALT和GOT浓度升高，且升高的程度与肝细胞受损的程度相一致。当胁迫程度增强，机体肝细胞死亡时，酶活性显著下降[16]。本研究中，曼氏无针乌贼体内ALT和GOT活性在60 r/min振荡频率下增加，随着频率增大，酶活性在120 r/min处理组出现显著降低，表明乌贼肝细胞先出现损伤，后发生死亡。本研究结果与硫化物胁迫下曼氏无针乌贼GOT活性变化规律一致[29]。振荡对乌贼的影响可能还包括喷墨后的微毒性作用。不同频率乌贼在振荡运输后期均发生了喷墨，虽然及时进行了换水，但可能仍有乌贼吸入墨而导致肝脏损伤。

软体动物不具备特异性免疫，吞噬作用在其防御机制中具有重要作用，ALP是其中一类重要的水解酶，异物被吞噬后与溶酶体结合，再被水解酶消化分解从而完成防御反应[29]。本研究中大于100 r/min的振荡频率下ALP活性显著增加，表明高频率振荡刺激了曼氏无针乌贼的免疫反应，这与低浓度条件下亚硝酸氮对曼氏无针乌贼胁迫、氨氮对栉孔扇贝(Chlamys farreri)胁迫下ALP的变化趋势一致[15,34]。高浓度亚硝酸氮、氨氮胁迫下曼氏无针乌贼和栉孔扇贝均出现了酶活性的下降，产生机体损伤，而本实验中高振荡频率下ALP酶活性未出现下降，表明高振荡频率并没有造成乌贼严重的机体损伤。SOD可以防止机体受到自由基的损害，受到轻度逆境胁迫时，SOD活性往往升高，而受到重度逆境胁迫时，SOD活性降低，此时机体受到损伤[15]。本研究中140和160 r/min的振荡频率下SOD活性显著升高，说明乌贼受到轻度逆境胁迫，以升高SOD活性来减少高频率对机体造成的自由基损伤。

3.4 死亡率与生理指标间的相关性

Spearman相关性分析应用于死亡率与免疫组化指标之间的相关性[35-36]。本研究中，不同振荡频率下死亡率与SOD活性、肌肉乳酸含量、ALP活性之间呈极显著正相关，随着振荡频率增加，以上各指标升高、死亡率增加，与乌贼在亚硝酸氮、氨氮等有害物质胁迫下的防御机制相似[15,34]。不同振荡频率下死亡率与肌肉和消化腺糖原含量、GOT活性、ALT活性之间呈极显著负相关。糖原含量越高，死亡率越低，与大口黑鲈、黑棘鲷幼鱼、大黄鱼等在运输振荡过程中能量消耗规律一致[11-12, 32]。

近年来，maximal information-based nonparametric exploration (MINE)算法为非参数变量的相关性分析提供了新策略。与其他基于特定函数的回归模型不同，MINE算法可以检测由多个因素驱动的复杂关系，该方法的最大优势在于其提供了在同一尺度下评价相关性的大小，从而找到关系最强的变量对[37-38]。MINE算法已经广泛应用于探索生物与环境参数之间的关系，为各类型变量关系提供了一种标准化的数据挖掘解决方案[39-40]。本研究利用MINE算法，得出不同振荡频率下死亡率与生理指标相关性较强的前5个生理指标，依次为GOT活性、肌肉糖原含量、ALT活性、肌肉乳酸含量和SOD活性，与Spearman相关性分析结果一致，且与前文已论述的硫化物、亚硝酸氮、氨氮及运输胁迫条件下的相关研究结果相一致。

综上所述，振荡频率显著影响成体曼氏无针乌贼的存活率，乌贼产生了一系列行为和生理反应来适应振荡产生的影响，肌肉能量耗尽和肝胰脏损伤可能是乌贼在运输过程中高死亡率的主要原因。建议运输过程中避免较大程度振荡的发生，振荡频率应低于100 r/min且运输时间少于3 h。

（作者声明本文无实际或潜在的利益冲突）