大型陶瓷坛发酵剁辣椒风味及微生物的空间差异性分析

肖 何，尹含靓，王馨瑶，刘 洋，王蓉蓉，蒋立文，2*

（1 湖南农业大学食品科学技术学院 长沙410128 2 广东省粤北食药资源利用与保护重点实验室 广东韶关 512000）

剁辣椒是一种传统发酵蔬菜食品，因其在发酵过程中产生特殊酸辣爽口的滋味，而备受消费者喜爱[1]。传统的发酵剁辣椒一般是将新鲜辣椒清洗，晾干表面水分，去把、去蒂后，斩拌成一定大小的片型，加入一定比例食盐拌匀后入陶瓷坛厌氧发酵。此类加工方法一般仅供家庭自做自食用。当前工业化生产的剁辣椒主要是以高盐腌渍一定时间的新鲜辣椒为原料，经脱盐、调味、装瓶、真空、封口、杀菌加工而成[2-3]。此法虽成本低，加工工艺简单，但脱盐会使产品丧失原始的发酵风味和营养物质。目前，产品发酵风味不足成为制约行业发展的短板。为了实现传统发酵食品产业升级，遵循古法发酵方式，保持传统产品风味保真性，采用大型陶瓷坛发酵剁辣椒，后续装瓶和灭菌，既能生产出具有传统发酵风味的剁辣椒，又能实现工业化生产。

发酵是一个动态过程，添加的食盐具有调整细胞渗透压的作用，使辣椒中的汁液流出，再加以重力作用，导致随着发酵时间的延长原料下沉，底部有大量汁液浸润，底部发酵处在固、液完全混合状态；中间部位虽有部分汁液流出，但仍以固相为主，空气很少；上部处于固态和气态接触状态，水分较少。因此，不同发酵层次间存在差异，造成发酵品质不稳定。目前，有研究集中在白酒的不同发酵空间层次的风味和微生物差异方面。杨康卓等[4]分析了五粮液原酒生产过程中的9 种具有特殊香气贡献的芳香族化合物的空间分布规律，为其“按质并坛”工艺提供了新理论。王雪山等[5]研究了清香型白酒发酵过程中不同发酵层次酒醅中的微生物种群结构及演替规律，结果发现不同层次酒醅微生物种群演替速率存在差异，且其乙醇产生速率不同，在一定程度上提升了白酒酿造的可控性及白酒品质的稳定性。Wang 等[6]对10 年和1 年酒窖的上、中、下层微生物及挥发性物质进行比较，发现不同空间位置的不同微生物组成导致白酒风味存在差异。然而，关于发酵蔬菜不同空间层次的品质差异研究仍较少。

本研究采用大型陶瓷发酵坛制作的剁辣椒为原料，通过添加或不添加复合保鲜剂，研究样品在不同空间层次上的风味和微生物差异性，并进一步探讨微生物与有机酸和挥发性物质的相关性，旨在为提升工业化生产剁辣椒的品质提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验材料取自湖南坛坛香食品科技有限公司试验基地。添加复合保鲜剂组：将辣椒剁碎后按其质量添加15%的食盐、0.05%柠檬酸、0.01%焦亚硫酸钠；不加复合保鲜剂组：将辣椒剁碎后按其质量添加15%的食盐。上述两组样品搅拌均匀后，分别装入大型陶瓷发酵坛（高度约120 cm，直径约60 cm）中进行发酵，每坛约550 kg，待发酵成熟（1年）后取样。以坛缘入口物料最高处为取样基点，坛子底部为取样最高点，分上、中、下3 层取样，分别为距离基点0～40 cm，40～80 cm，80～120 cm 处，每层样品取中心及周边4 个点混合。添加和不添加复合保鲜剂的上、中、下分别命名为FTS、FTZ、FTX 和TS、TZ、TX，具体取样信息见图1。取样后及时密封，并于24 h 内冷藏运输至实验室用于样品分析。

图1 样品取样信息Fig.1 Sample sampling information

氯化钠、铬酸钾、氢氧化钠、无水乙醇、硝酸银、邻苯二甲酸氢钾、硝酸、酚酞均为分析纯级，国药集团化学试剂有限公司；甲醇、磷酸为色谱纯级，国药集团化学试剂有限公司；草酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、丁二酸、乳酸、酒石酸、二辛醇均为色谱纯级，上海源叶生物科技有限公司；Qubit ds-DNA HS Assay Kit，美国Invitrogen Life Technologies 公司；平板计数琼脂培养基，广东环凯微生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

7890B-5977A 气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent 公司；HMS-901C 磁力加热搅拌器，深圳博大精科生物科技有限公司；Water Alliance E2695超高效液相色谱仪，美国沃特世公司；TG16-WS台式高速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；MiSeq pe300 测序仪，美国Illumina 公司；Tanon-2500 型电泳仪和凝胶成像仪，上海天能公司。

1.3 试验方法

1.3.1 有机酸含量的测定 参考《食品安全国家标准 食品中有机酸的测定》（GB 5009.157-2016）[7]，采用高效液相色谱进行测定。色谱条件：色谱柱：Agilent TC-C18（2）250 mm×4.6 mm；流动相：0.1%磷酸溶液∶甲醇=97.5∶2.5（体积比）；流速：1.0 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：20 μL；检测波长：210 nm。

1.3.2 挥发性成分的测定 参照Xu 等[8]方法并稍作修改。准确称取2.5 g 剁辣椒样品置于15 mL 顶空进样瓶中，加入3 mL 饱和NaCl 溶液，再加入2-辛醇（20 μL，0.068 mg/mL）作为内标，用密封垫封口，涡旋振荡30 s。随后将其放入70 ℃加热块中平衡15 min，使剁辣椒挥发性组分充分挥发。然后将SPME 针插入萃取瓶中推出纤维头，保持70℃顶空吸附40 min，随后迅速将萃取头插入GC 进样口，并推出纤维头，250 ℃解吸5 min 后进行数据采集。

GC-MS 条件：色谱柱为DB-5MS（30 m×250 μm，0.25 μm），载气为He（99.999%），流速1 mL/min；进样模式为不分流；进样口温度250 ℃条件；升温条件为40 ℃保持3 min，以5 ℃/min 升至150℃，以10 ℃/min 升至250 ℃保持5 min。离子源温度230 ℃，电子能量70 eV，质量扫描范围m/z 33～500。用AMDIS 对色谱图进行自动解卷积，得到的峰质谱图与NIST 文库（NIST 2011）进行比较，并在相同条件下测定正构烷烃标准品的保留时间，以此计算各色谱峰的保留指数，确定各个色谱峰对应的化合物。保留指数计算见公式（1），采用内标法进行定量，含量计算见公式（2）。

式（1）中，I——保留指数；n——碳数；ti——待测挥发性成分保留时间，min；tn——具有n 个碳原子的正构烷烃的保留时间，min；tn+1——具有n+1 个碳原子的正构烷烃的保留时间，min。

1.3.3 高通量测序方法 使用OMEGA 土壤提取试剂盒对各样品总DNA 进行提取，提取步骤均按试剂盒说明书完成。以剁辣椒总DNA 为模板，进行细菌16S rDNA V3-V4 区域扩增。引物为338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。PCR 扩增体系为25 μL 包含DNA 模板25 ng，上、下游引物各为2.5 μL 和12.5 μL 的PCR 预混合物。PCR 扩增条件为98 ℃预变性30 s，98 ℃变性10 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循环35 次；最后72 ℃延伸10 min。取PCR 产物10 μL，用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，随后将检测合格样品送至杭州联川生物技术有限公司进行高通量测序。

1.3.4 菌落总数的测定 参照《食品安全国家标准 菌落总数的测定》（GB 4789.2-2022）[9]。

1.3.5 数据分析 每组试验均重复3 次，结果以“平均值±标准差”表示。采用SPSS 26 处理数据并进行显著性分析，使用origin2021b 进行数据绘图。利用OmicStudio 工具进行生物信息学分析和相关性分析（https：//www.omicstudio.cn/tool）。

2 结果与分析

2.1 不同空间层次发酵剁辣椒的有机酸含量变化

不同有机酸具有不同的酸味特征[10]，其组成是衡量剁辣椒风味品质的重要指标。由表1 可知，所有剁辣椒样品中含量最高的有机酸均为柠檬酸，占比高达49.54%～60.06%。在空间层次上，两组样品中有机酸含量变化基本一致，上层的丁二酸含量均显著高于中层和下层（P＜0.05）；中层的草酸含量显著高于上层和下层（P＜0.05）；下层的苹果酸和乙酸含量均较低；且乳酸在下层均未检出，这可能是由于下层高溶度盐水在一定程度上抑制了乳酸菌的发酵。此外，添加复合保鲜剂组的草酸、乙酸、苹果酸、柠檬酸、乙二酸含量普遍高于不添加组，而不添加复合保鲜剂组只有乳酸含量高于添加组。导致这些差异的原因可能是加入柠檬酸和焦亚硫酸钠对微生物发酵产生一定影响，后续将对其进行相关性分析。

表1 不同空间层次有机酸含量（g/kg）Table 1 The content of organic acids in different spatial levels（g/kg）

2.2 不同空间层次挥发性物质分析

通过GC-MS 对6 组样品的挥发性物质进行检测，其总离子流色谱图如图2 所示，各样品检出的挥发性物质种类及含量见表2。从表中可看出，6 组样品中共检出64 种挥发性物质，包括11 种醇类、4 种醛类、8 种萜烯、10 种烷烃、25 种酯类及6 种其它物质。然而，各组样品的挥发性物质种类存在差异，其中TS 检出36 种、TZ 30 种、TX 32种、FTS 40 种、FTZ 26 种、FTX 28 种。6 组样品中共有13 种物质为共有的挥发性物质，分别为4-甲基-1-戊醇、α-松油醇、α-喜马沙拉烯、g-喜马沙拉烯、（+）-香橙烯、2-甲基十四烷、十六烷、2-甲基十六烷、十七烷、水杨酸甲酯、4-甲基戊基2-甲基丁酸酯、棕榈酸甲酯、棕榈酸乙酯。总体而言，从空间层次上看，添加和不添加复合保鲜剂的上层样品挥发性物质种类均明显多于中层和下层。

表2 不同空间层次挥发性成分化学组成与含量Table 2 The chemical composition and content of volatile componentsin different spatial levels

图2 不同空间层次挥发性成分总离子流色谱图Fig.2 Total ion chromatogram of volatile components in different spatial layers

由图3 可知，各组样品挥发性物质含量也存在显著差异（P＜0.05），含量从高到底依次为TS（14 085.46 μg/kg）、FTS（8 695.60 μg/kg）、TX（2 220.60 μg/kg）、FTX（1 502.34 μg/kg）、TZ（735.75 μg/kg）、FTZ（720.82 μg/kg）。总体而言，两组样品在空间层次上皆为上层挥发性物质含量最高，其次为下层，中层含量最低。这可能由于上层主要为固态，水分较少且与气相接触，微生物有氧发酵较强烈；中层虽以固相为主，但含有部分汁液，导致微生物间可能存在竞争关系从而抑制发酵[11]；下层有大量汁液浸润，使发酵处在固液完全混合状态，更适合微生物厌氧发酵，且发酵汁液富含营养物质。上述差异使各空间层次微生物组成不同，从而导致发酵程度存在差异。然而，对于同一空间层次而言，不添加复合保鲜剂组的挥发性物质含量均高于添加组，表明复合保鲜剂在一定程度上能抑制发酵，从而减少挥发性物质的生成。

图3 不同空间层次挥发性物质含量Fig.3 The content of volatile substances in different spatial layers

图4 不同空间层次细菌群落的主成分分析Fig.4 Principal component analysis of bacterial communities indifferent spatial levels

结合表2 和图3 可发现各组样品挥发性物质组成相似，其最主要的挥发性物质均为萜烯类，其次分别是酯类、烷烃类、醇类、醛类。萜烯类化合物大都阈值较低，对风味贡献较大[12]。从空间层次上看，萜烯类化合物的含量为上层＞下层＞中层。对于添加或不添加复合保鲜剂组，除不添加组上层样品萜烯类物质含量高于添加组外，两组样品在中层和下层并无明显差异。各组样品中最主要的萜烯类物质均为（+）-香橙烯，其具有较强烈的果香、花香等香气特征，是辣椒及其制品中的主要挥发性物质之一[13-15]。酯类物质被认为是发酵食品中令人愉悦的甜味和果味香气的重要来源[16]。所有样品中均检出水杨酸甲酯、4-甲基戊基2-甲基丁酸酯、棕榈酸甲酯和棕榈酸乙酯，使得剁辣椒具有辣椒香气特征的“青”和“刺激”气味[13]。对于酯类物质而言，从空间层次上其含量依次为上层＞下层＞中层，且对于同一空间层次而言，不添加复合保鲜剂组其酯类含量普遍高于添加组。尽管烷烃类化合物在各样品中均存在，但由于其气味阈值高，认为其对香气并无显著影响[17]。所有样品中醇类化合物均以异戊醇、4-甲基-1-戊醇、α-松油醇、苯甲醇、芳樟醇为主，它们都具有特殊香气，且阈值较低，赋予发酵辣椒香气作用较大，如异戊醇具有辣的味道，并带有醇香、醚香、香蕉香；苯乙醇具有新鲜面包香，清甜的玫瑰花香[18]；芳樟醇带有浓青带甜的木青气息，似玫瑰木。从空间层次来看，上层样品醇类化合物含量最高，其次为下层，中层含量最低；而添加和不添加复合保鲜剂对样品中醇类化合物含量无明显影响。总之，样品中风味化合物存在差异可能是由于不同空间层次微生物的差异造成的[19]。

2.3 不同空间层次细菌多样性分析

2.3.1 α-多样性分析 从α-多样性指数（表3）可知，每个样品的覆盖率（Coverage 指数）都在99%以上，说明测序深度基本覆盖所有细菌，表示本次测序结果能代表样本的真实情况[20]。Chao1 和Observed_otus 主要是估计群落中包含物种的数目，Simpson 和Shannon 指数主要是综合体现物种的丰富度和均匀度[21]。从表中可看出，FTS 的Chao1、Observed_otus、Shannon 和Simpson 指数均显著低于其它样品（P＜0.05），表明FTS 剁辣椒细菌种群多样性低于其它样品。

表3 不同空间层次细菌群落多样性指数统计Table 3 Statistics of bacterial community diversity index in different spatial levels

2.3.2 β-多样性分析 细菌群落的主成分分析见图3。由图中可知，两坐标轴的贡献率之和为99.52%，能较好的反映剁辣椒样品的主要特征。其中，TS 和FTS 与其它样品的距离均较远，说明其细菌菌群结构差异大，这种差异主要体现在样品的空间分布上。其次，两组样品间细菌菌群结构在上层也出现显著差异，表明影响细菌菌群结构的原因可能与空气接触有关，且添加与不添加复合保鲜剂对细菌菌群结构的影响差异主要体现在上层。

2.3.3 物种注释及分类 根据测序及物种注释结果，门分类水平上样品菌群差异结果见图5，属分类水平上样品菌群差异结果见图6。高通量测序显示所有剁辣椒中的细菌种群可归属于7 个门，其中平均相对丰度＞0.1%的仅有蓝藻菌门（Cyanobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes），其在样品中共占比超过99%。韩俊燕等[22]也发现蓝藻菌门（Cyanobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）是发酵辣椒的主要优势菌门。其中，蓝藻菌门（Cyanobacteria）在FTS 中占比最高为66.14%，厚壁菌门（Firmicutes）在FTX 占比最高为42.71%，变形菌门（Proteobacteria）在TS 中占比最高为12.69%。

图5 门分类水平上的相对丰度Fig.5 The relative abundance in the phylum level

图6 属分类水平上的相对丰度Fig.6 The relative abundance in the genus taxonomic level

如图6 所示，在属分类水平上，未分类产氧光细菌（Oxyphotobacteria_unclassified）为6 个样品的优势菌属，其在TS、TZ、TX、FTS、FTZ 和FTX 中相对丰度分别为50.33%，56.40%，57.15%，66.14%，59.27%和54.21%。未分类产氧光细菌（Oxyphotobacteria_unclassified）是一种好氧微生物[23]，其增殖可能与坛中剁辣椒间存在空隙有关，同时也与高通量测序检测时DNA 编码区部分重叠有关，其并不是辣椒发酵的主要微生物。根瘤菌（Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium）相对丰度为1.53%，是辣椒中主要的内生固氮菌之一[24]，主要存在于土壤与环境中，对发酵影响有限，不添加复合保鲜剂组普遍高于添加组，且越下层其含量越高。其在空间层次分布的差异与罗娜等[24]在根瘤菌适宜低氧微环境的研究结果一致，其与检测方法有一定关系。

在上述主要微生物存在干扰的情况下，平均相对丰度＞1%的菌属还有克雷伯菌属（Klebsiella）10.44%，肠杆菌属（Enterobacter）9.20%，泛菌属（Pantoea）4.48%，四联球菌（Tetragenococcus）2.94%，葡萄球菌（Staphylococcus）2.79%，其与产品品质密切相关。其中，克雷伯菌属对总酸的贡献最大[25]，能提高产品风味，在样品中占比依次为TS＞FTX＞TX＞FTZ＞TZ＞FTS。肠杆菌属一般为不致病菌或条件致病菌，是人体内的正常微生物，能产生短链脂肪酸和有机酸[26]，部分肠杆菌能利用糖酵解和戊糖磷酸途径对糖进行降解，其在样品中占比依次为FTX＞FTZ＞TS＞TX＞TZ＞FTS。葡萄球菌对于高盐及其它复杂环境具有较好的耐受力[27]，能将碳水化合物代谢为有机酸[28]，在样品中占比依次为FTS＞TZ＞TS＞TX＞FTX＞FTZ。四联球菌广泛存在于含盐的腌制类发酵食品中，是一种嗜盐乳酸菌[29]，可参与氨基酸的合成并生成醛、醇、酮和酯等挥发性风味物质，从而提升发酵食品的风味和口感[30]，在样品中占比依次为TS＞TZ＞FTS＞TX＞FTZ＞FTX，不添加复合保鲜剂组普遍高于添加组且越上层其含量越高。

2.4 不同空间层次菌落总数差异

不同空间层次菌落总数差异如表4 所示，可看出添加复合保鲜剂组菌落总数低于不添加组，这可能是由于蔬菜发酵过程中酸性条件利于部分微生物生长，从而抑制其它有害微生物的生长。这与丰度结果存在一定差异，表明可培养微生物与环境也存在密切关系。此外，不添加复合保鲜剂组的样品其下层菌落总数最高，为2.5×104CFU/g，而添加组样品中，下层菌落总数却最低，仅为2.7×103CFU/g，这可能是由于保鲜剂溶于发酵汁并沉积于下层，对微生物起到了更好的抑制作用。

表4 不同空间层次菌落总数差异Table 4 The differences in the total number of colonies at different spatial levels

2.5 相关性分析

2.5.1 微生物与有机酸的相关性分析 对剁辣椒中相对丰度＞1%的细菌属和6 种有机酸进行了相关性分析。如图7 所示，肠杆菌属（Enterobacter）和未分类产氧光细菌（Oxyphotobacteria_unclassified）可分别促进柠檬酸（Citric acid）和乙酸（Acetic acid）的产生。泛菌属（Pantoea）与草酸（Oxalic acid）、乙酸（Acetic acid）、柠檬酸（Citric acid）的产生具有相关性（P＜0.05）。这与Zhao 等[31]的研究结果一致，泛菌属（Pantoea）是酒精发酵的主要微生物之一，可以促进乙酸的产生。葡萄球菌属（Staphylococcus）与乳酸呈正相关（P＜0.05）。冯美琴等[28]也发现葡萄球菌能够代谢碳水化合物，并将其转化为乳酸。而四联球菌（Tetragenococcus）与丁二酸（Succinic acid）、乳酸（Actic acid）、苹果酸（Malic acid）的产生呈正相关（P＜0.05）。这与房峻等[32]发现嗜盐四联球菌可增加酱油中苹果酸、乳酸等的含量结果一致。

图7 细菌属与有机酸之间相关性分析Fig.7 The correlation analysis between bacteria and organic acids

2.5.2 微生物与关键性挥发性成分的相关性分析 对剁辣椒样品中主要细菌属与挥发性物质进行了相关性分析。如图8 所示，4 个细菌属与9种挥发性物质呈显著正相关（P＜0.05）。其中，四联球菌属（Tetragenococcus）与3-蒈烯（16）、十四酸乙酯（44）、反油酸乙酯（50）、乙酸（59）呈显著正相关（P＜0.05）。刘佳乐[33]研究也发现嗜盐四联球菌能促进酸类、酯类等风味物质的产生。克雷伯菌属（Klebsiella）与丙基环丙烷（24）、2-甲基十三烷（25）、4-甲基戊基4-甲基戊酸酯（40）呈显著正相关（P＜0.05），说明其可能对烷烃类及酯类物质的产生具有一定的促进作用。泛菌属（Pantoea）可极显著促进1-十一醇（7）的产生（P＜0.01），葡萄球菌属（Staphylococcus）与苯乙醇（5）的产生呈显著正相关（P＜0.05）。付晶晶[34]也发现添加木糖葡萄球菌发酵香肚可增加醇类物质的种类及相对含量。可见，微生物对剁椒香气形成有重要作用。

图8 细菌属与挥发性物质之间相关性分析Fig.8 The correlation analysis between bacterial genera and volatile substances

3 结论

通过对大型陶瓷罐发酵的剁辣椒在不同空间层次上的差异进行研究，发现各空间层次的有机酸、挥发性物质含量和细菌组成均差异显著（P＜0.05）。在所有样品中共检出64 种挥发性物质，其中萜烯类是最主要的挥发性物质，其次分别是酯类、烷烃类、醇类、醛类。各空间层次总挥发性物质含量依次为上层＞下层＞中层，且添加复合保鲜剂组相比于未添加组能一定程度上抑制挥发性物质的生成。未分类产氧光细菌、克雷伯菌属、肠杆菌属、泛菌属、四联球菌、葡萄球菌属、根瘤菌属是样品中的优势菌属，且添加保鲜剂能明显降低样品中的细菌菌落总数。其中，未分类产氧光细菌、肠杆菌属、四联球菌、泛菌属对有机酸产生的贡献较大；而四联球菌属、克雷伯菌属、泛菌属、葡萄球菌属对各种风味化合物的形成有积极影响，其具有作为核心功能微生物的潜力。本研究揭示了剁辣椒在不同发酵空间层次上的品质差异，为提升工业化生产剁辣椒品质提供一定的理论依据。