微生物检验过程中微滤膜分离技术的应用价值

李新红 李忠

微生物检验是疾病预防控制中心（简称疾控中心）日常工作之一，疾控中心通过各种现代化的实验室设备和技术，对各种微生物特别是病原微生物进行鉴定、检测和分析，可以为感染性疾病防控及相关突发公共卫生事件的应急处理提供重要依据，是创造安全环境、保护公众健康的重要手段[1]。微生物检验项目众多，在细菌总数测定方面，平板计数法是国标规定的检测方法，此法精准度高，但是微生物培养时间长，因此检验耗时久，检验效率不高，难以满足疾病预防控制中心实际工作需要[2]。对此，国内外学者进行了大量微生物快速检验方法的研究，力求保证检验高精准度的同时，简化检验程序，缩短检验时间，提高检验速度和效率。膜分离技术是在分子水平上将不同粒径的混合物通过具有一定孔径的半透膜，从而实现不同粒径混合物的选择性分离，依据半透膜孔径大小可以分为微滤膜、超滤膜、纳滤膜等多种技术类型[3]。其中，微滤膜分离技术所用过滤膜的过滤孔径在0.1～1.0 μm，不仅可以截留悬浮物和大尺寸胶体，亦可截留细菌及部分病毒，因此不仅在食品生产处理、污废水处理、海水淡化等领域广泛应用，近年也在实验室标本微生物分离与检验中得到推广[4]。文章现以济南市疾病预防控制中心近年接收的86 份微生物待检样本为例，以平板计数法为对照，探讨微滤膜分离技术在微生物检验中的应用效果，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

以2022 年1 月—2023 年6 月济南市疾病预防控制中心接收的86 份微生物待检样本为研究对象。纳入标准：（1）待检样本的量充足（≥20 mL），可以同时满足2 种微生物检验方法的检验需要，样本类型不限。（2）样本采集规范，封闭送检。排除标准：（1）疑似污染样本。（2）检验数据资料不全。待检样本类型：生活饮用水样本35 份，血液样本21 份，食品样本17 份，污水样本9 份，其他4 份。

1.2 方法

1.2.1 设备与材料

医用YB-MDX23 型膜式电动吸引器（上海医疗器械产业公司）；STV3 无菌薄膜过滤器（浙江宁海白石药检仪器厂）；LRH-250 型生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；OLYMPUS BX53 三目显微镜（奥林巴斯光学技术公司）；φ50 mm×0.45 μm 的微孔滤膜（上海新亚净化器件厂）；HealForce B2 型生物安全柜（力康医疗器械科技有限公司）；BXM-30R 型立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司）；计数琼脂培养基（恒凯生物科技有限公司）；营养琼脂培养基（北京陆桥技术有限公司）；J-HH-4A 型精密恒温水浴锅（冠森生物科技）；500 mL 无菌锥形瓶（赛默飞世尔科技有限公司）；90 mm 无菌培养皿（上海晶安生物科技有限公司）；绿脓杆菌ATCC9027，大肠杆菌ATCC25922，金黄色葡萄球菌ATCC6538，阴沟肠杆菌CMCC45301，均由中国药品生物制品检定所提供。培养液：蛋白胨10 g+牛肉膏粉3 g+氯化钠0.05 g+氯代三苯基四氮唑0.01 g+1 000 mL 蒸馏水，充分溶解后调整酸碱值至（7.5±0.1），脱脂棉球过滤后120℃灭菌20 min 备用。生理盐水为氯化钠8.5 g+1 000 mL 蒸馏水，脱氯剂为硫代硫酸钠1.8 g+100 mL 蒸馏水，灭菌方法同培养液。

1.2.2 实验方法

从每份待检样本中各取10 mL 以平板计数法进行微生物检验，另各取10 mL 基于微滤膜分离技术获取菌细胞进行微生物检验。

平板计数法检验方法：检验操作严格遵照国家标准进行，将待检样本置于培养基上，37 ℃恒温下孵育24～48 h，显微镜下观察有无菌落分布并统计细菌计数，检验结果以CFU/mL 为单位报告[4]。

微滤膜分离技术检验方法：吸取1 mL 待检样本置于99 mL 无菌蒸馏水中，配置成含菌浓度＜100 CFU/100 mL的样本备用。取不锈钢过滤装置，预先高温灼烧，充分灭菌，然后夹取无菌的微孔滤膜置于过滤头上并正确安装滤杯。将100 mL 稀释后的待检样品摇匀并加入滤杯中，以真空泵抽滤至全部液体通过滤膜，然后加入100 mL 无菌生理盐水2 次抽滤至全部液体滤完，关闭开关。轻夹微孔滤膜边缘，正面朝上缓慢移至培养基上，要保证滤膜与培养基之间完全贴紧，无褶皱、卷边及气泡夹留。盖好皿盖，放入恒温箱内37℃恒温下孵育15～24 h，显微镜下观察有无菌落分布并统计细菌计数。基于微滤膜分离技术的微生物检验全过程于洁净工作台进行，严格遵循无菌化原则，所用仪器和滤膜均高压灭菌，全程质量控制，另设空白滤膜作为阴性对照，以保证检验方法的可靠性。细菌计数采用公式Q ＝F/G 进行计算，式中F 为全部菌落数，G 为过滤样本量，Q 为每1 mL 样本中的细菌总数，样本稀释则乘以稀释倍数。

初检完成后进行确认实验，将2 种检验方法第1 次检测确认的阳性样本直接接种到培养液中，划出典型菌落，再以培养基同法培养后，以AP120E 标准进行鉴定，同时对2 种方法检验结果不一致的样本重新进行检验。确认试验主要是2 次复检第1 次检测的阳性结果是否存在假阳性情况以及2 种检验是否存在假阴性情况，2 次检验结果一致判定为真阳性或真阴性，2 次检验结果不符则再次复检，以3 次检验中2 次相同的检验结果为最终检验结果。

另外，从2 种方法检验结果为阳性的样本中随机抽样进行回收率实验。从培养基斜面上取1 mL 新鲜培养的阳性菌，加入9 mL 生理盐水中充分振荡摇匀，取1 mL 菌悬液再次加入9 mL 生理盐水中，得到浓度30～300 CFU/mL 的活性菌悬液。另以样品替代生理盐水，加阳性菌同法制作样液，稀释度与菌悬液相同。采用活菌计数实验，分别取1 mL 菌悬液和1 mL 样液，37℃恒温孵育48 h 后计数，分别记为A 和B。以公式C ＝（A-B）/A×100%计算回收率。

1.3 观察指标

（1）比较平板计数法与微滤膜分离技术的微生物检出率。（2）比较平板计数法与微滤膜分离技术检验微生物的出报告时间。出报告时间从样本开始进行前处理起算。（3）比较平板计数法与微滤膜分离技术的活菌回收率。

1.4 统计学处理

采用SPSS 21.0 统计学软件进行数据分析。计量资料以（）表示，组间比较采用独立样本均数t检验；计数资料以n（%）表示，采用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2 种检验方法的微生物检出率比较

将平板计数法与微滤膜分离技术对86 份样本的细菌总数检验结果进行配对实验，2 种方法共检出阳性样本47 份，其中微滤膜分离技术检出45 份，占比为95.74%，平板计数法检出阳性样本47 份，占比为100%。47 份样本中，2种方法共同检出阳性45 份，平板计数法单独检出2 份，微滤膜分离技术未单独检出阳性样本。2 种方法初检86 份样本的阳性检出率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），2例平板计数法检验阳性的样本经微滤膜分离技术复检均明确阳性，基于复检结果，微滤膜分离技术初诊漏检2 例，2种方法的复检阳性率与漏检率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1、表2。

表1 2 种检验方法初检的配对实验结果（n ＝86）

表2 2 种检验方法的初检与复检结果比较[份（%）]

2.2 2 种检验方法出报告时间比较

平板计数法的培养时间为24～48 h，平均培养时间（32.75±4.36）h ；微滤膜分离技术的培养时间为15～24 h，细菌培养过程中通过观察发现，培养达到24 h 时菌落即可清晰计数，延长培养时间至48 h，未见更多菌落生长，平均培养时间（20.24±3.17）h，差异有统计学意义（t＝21.521，P＜0.001）。

2.3 2 种检验方法的活菌回收率比较

微滤膜分离技术的阳性菌回收率总体高于平板计数法，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 2 种检验方法的阳性菌回收率比较

3 讨论

微滤膜分离技术以静压差为推动力进行膜筛分，可以从气相和液相的物质中去除和截留各种直径大于半透膜孔径的物质，从而实现分离、净化和浓缩[5]。技术优点：孔径均匀，过滤精度高，可以全部截留大于孔径的微粒；孔密度高，膜阻力小，孔体积占膜体积的70%以上，过滤速度快；孔膜厚度不超过150 μm，吸附量极少；微滤膜为高分子材料，不会有脱落介质，过滤纯度高[6]。

文章体现了《临床微生物学检验过程的生物安全风险管理专家共识》[7]的临床参考，分别以微滤膜分离技术和平板计数法对86 份待检样本进行微生物检验，2 种方法共检出阳性样本47 份，根据复检结果微滤膜分离技术初诊漏检2 例，2 种方法的初检与复检阳性率以及漏检率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。提示2 种方法用于微生物检验的效果相当。微滤膜分离技术可以通过膜筛分截留样本中的菌细胞，然后再通过实验室方法培养和检验，直径大于半透膜孔径的菌细胞均可以通过微滤膜分离技术获取到，因此检验的敏感性与准确性很高，根据本研究结果是可以替代平板计数法使用的[8]。有研究分别以平板计数法和微滤膜分离技术进行微生物检验，结果显示阳性检出率分别为98.15%和94.37%，检验敏感度分别为97.89%和92.10%，差异无统计学意义（P＞0.05）[9]。另有学者分别以滤膜法、多管发酵法和酶底物法检测水体中的总大肠菌，结果显示滤膜法与多管发酵法均准确检出阳性菌，酶底物法假阳性1 例[10]。由此可见，微滤膜分离技术用于微生物检验的阳性检出率高，与本研究结论相符。另外，微滤膜分离技术所用滤膜为单片无菌包装，检验时可直接取用，不仅可以节省灭菌时间，还能避免和减少2 次污染所致假阳性问题，更符合认证规范[11]。不过，由于微滤膜的孔径十分微小，如果待检样本中大尺寸悬浮微粒的量较大或是含有毒素成分，则可能影响微生物的正常培育，从而导致检验结果不准确[12]。

出报告时间方面，本研究中微滤膜分离技术的平均培养时间（20.24±3.17）h，短于平板计数法（32.75±4.36）h，差异有统计学意义（P＜0.05），与文献报道结论相符[13]。可见微滤膜分离技术的培养时间更短，微生物检验出报告更快。通常情况下，平板计数法的微生物培养时间在24～48 h，而基于微滤膜分离技术的微生物培养只需要15～24 h 就能让菌落生长完全，此时即可清晰计数，延长培养时间并不会有更多的菌落生长。这主要是因为基于微滤膜分离技术自带浓缩效应，滤膜上的菌量高，生长与增殖更快，因此检验时间被大大缩短，检验效率得到提升，这对于及时发现待检样本中的致病微生物、保障民众健康具有重要价值[14]。另外，以平板计数法进行微生物培养时，有些菌落埋藏在培养基内，计数困难，也影响检验效率。而使用微滤膜分离技术进行检验时，菌落直接在滤膜上培育生长，菌落个大良好，易于计数，也在一定时间上缩短了检验时间。

此外，本研究中微滤膜分离技术的阳性菌回收率总体上也高于平板计数法，与文献报道结论相符[15]。提示前者能更加真实地反映微生物对样本的污染程度，不过需要注意的是，如果在微滤膜分离技术中浓度过大的菌悬液，过量的菌细胞聚集在滤膜上，也会给微生物培养生长和计数造成困难，有导致回收率降低的可能。因此，应用微滤膜分离技术需要控制样本的稀释度，一般宜选择活性菌浓度稀释在30～300 CFU/mL 的菌悬液，以保证检验效果。

综上所述，微生物检验中应用微滤膜分离技术的阳性检出率与平板计数法相当，但前者的培养时间更短，微生物检验出报告时间早，阳性菌回收率更高，效果优于平板计数法，有助于提高检验效率，更真实地反映样品的微生物污染程度。