生物炭添加对餐厨废弃物堆肥腐殖酸形成及微生物演替的影响*

詹亚斌 张阿克 陈云峰 夏贤格 杨 利#

(1.农业农村部废弃物肥料化利用重点实验室,湖北 武汉 430064;2.湖北省农业科学院植保土肥研究所,湖北 武汉 430064;3.阜阳市农业科学院,安徽 阜阳 236065)

餐厨废弃物是特殊的有机固体废物,包含大量的有机质[1]。中国2021年的餐厨废弃物产生量已经达到1.2亿t[2]。随着社会发展以及垃圾分类工作的推进,餐厨废弃物产生量将持续增加。好氧发酵是处理有机固体废物的一个常见方法,堆肥产品富含养分和腐殖酸,这有利于有机固体废物的资源回收和环境的可持续发展[3]。

腐殖酸是堆肥腐熟的标志性产物,且腐殖酸有利于植物生长、土壤修复[4]。腐殖酸形成机制主要包括木质素学说、多酚学说、微生物多酚学说、微生物合成学说、细胞自溶学说、糖-胺缩合学说等。大多数学说都认可微生物驱动的生物过程对腐殖酸形成至关重要,且堆肥物料来源对腐殖化过程影响显著。(1)富含木质素的有机废弃物堆肥腐殖化过程主要依赖以木质素-蛋白质复合体为核心的木质素学说,强调难分解的木质素在微生物作用下,经过一系列的脱甲氧基和氧化过程,形成具有酚羟基和羧基基团的腐殖酸形成基本结构单元——类木质素,并与源于微生物的含氮化合物聚合形成腐殖酸[5]。(2)富含结构相对简单的非木质素(纤维素类、蛋白质类)的有机废弃物堆肥中,多酚学说和微生物多酚学说居主导地位,微生物自身合成或非木质素有机质分解得到的酚被微生物分泌的多酚氧化酶氧化为醌,并与含氮化合物缩合形成腐殖酸[6]。(3)富含非木质素类有机废弃物堆肥,纤维素、蛋白质等有机质分解产生的还原糖与氨基酸缩合、重排,并在碱性条件下形成小分子物质聚合形成腐殖酸,该过程没有酚的直接参与,一般被称为美拉德反应(即糖-胺缩合过程)[7]。本质上就是微生物将大分子物质分解为小分子化合物,这些小分子化合物一部分被微生物作为营养物质分解利用,一部分作为前体逐渐缩合形成腐殖酸。

堆肥腐殖酸的形成受到许多因素的影响。高温有利于腐殖酸前体的形成,有利于堆肥的腐殖化[8]。添加石灰可以促进餐厨废弃物堆肥腐殖酸的形成,但是会加速氮素的损失[9-10]。低曝气量有利于鸡粪堆肥腐殖酸复杂组分的形成,而高曝气量则有利于腐殖酸简单组分的形成[11]。高含水率会加剧芳香族腐殖酸的降解[12]。添加黏土、沸石、生物炭等也可以促进堆肥腐殖酸的形成[13-14]。生物炭具有多孔的特性,有利于微生物的繁殖,最终促进有机物向腐殖酸转化,且生物炭本身含有大量腐殖质。生物炭多孔的特性也许可以保护腐殖酸的简单组分,避免它被微生物分解。我国农作物秸秆超过8.2亿t,未利用的占25%以上[15]。秸秆炭化可以减少秸秆燃烧造成的空气污染,还可以实现固体废物的高效利用,这为生物炭的大规模应用奠定了基础。

餐厨废弃物堆肥过程中添加生物炭促进腐殖酸形成的微生物机制并不知晓,因此,本实验主要研究生物炭添加对餐厨废弃物堆肥腐殖酸前体转化、腐殖酸形成、微生物演化的影响。本研究对生物炭在餐厨废弃物肥料化上的应用具有参考价值。

1 材料与方法

1.1 实验材料

餐厨废弃物取自苏州市某中学食堂;锯末购买自某木材厂;生物炭购买自某农业科技有限公司,将玉米秸秆放入管式炉中,充入N2并密封,在常压500 ℃条件下,热解2 h制成。具体性质见表1。

表1 堆肥材料基本性质Table 1 Basic properties of composting materials

1.2 实验设计

将餐厨废弃物与锯末按照85∶15(鲜质量比)混合均匀,一共设置两个处理,对照组(CK)不添加生物炭,处理组(BC)按照堆体干质量的5%添加生物炭;初始含水率调节至60%,在长、宽、高、壁厚分别为67.5、48.0、41.0、3.5 cm的反应器中装入60 kg物料;每个处理3个重复。在堆肥的1、5、10、15 d多点取样,混合成为1个样品后采用四分法收集样品300 g,其中200 g于4 ℃条件下保存,用于理化指标、腐殖酸前体的测定,100 g于-20 ℃保存,用于微生物的测定[16]。

1.3 分析方法

腐殖酸前体(还原糖、氨基酸、多酚)的测定参考文献[17]。腐殖酸的提取、测定参考文献[18]。采用脱氧核糖核酸(DNA)提取试剂盒(Omega Biotek,Inc)提取堆肥总DNA,经扩增纯化后送往上海某生物医药科技有限公司测序;上游引物为515F(5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’),下游引物为909R(5’-CCCCGYCAATTCMTTTRAGT-3’),聚合酶链式反应(PCR)扩增体系、程序参考文献[19]。

1.4 数据分析

还原糖、氨基酸、多酚、胡敏酸(HA)、富里酸(FA)、HA/FA(质量比),HA组分、FA组分、微生物相对丰度(门、属)、多样性指数(Chao1指数)、丰富度指数(Shannon指数)通过OriginPro 2021作图,腐殖酸三维荧光平行因子通过Matlab 2013分析。

2 结果与分析

2.1 生物炭添加对堆肥腐殖酸前体转化的影响

腐殖酸前体包含还原糖、氨基酸、多酚等,这些前体通过美拉德反应缩合成为腐殖酸[20]。与此同时,这些前体也可以作为能源被微生物分解利用,因此前体的含量通常呈下降趋势(见图1)。本次实验中,随时间的增加,还原糖和氨基酸呈现下降的趋势(见图1(a)、图1(b)),且BC大体低于CK。而多酚则呈现先上升然后下降的趋势(见图1(c)),多酚的上升归因于木质纤维素的降解,下降则归因于多酚向腐殖酸的转化。堆肥10～15 d,BC的多酚低于CK。堆肥结束时,BC的还原糖、氨基酸、多酚分别为2.05、1.57、2.25 mg/g,分别比CK低1.97、0.68、0.43 mg/g。以上结果表明添加生物炭可以促进还原糖、氨基酸、多酚向腐殖酸的转化。

图1 生物炭添加对餐厨废弃物堆肥腐殖酸前体转化的影响Fig.1 Change of humus precursors concentration during composting with biochar addition

2.2 生物炭添加对堆肥腐殖酸含量、组分的影响

HA、FA、HA/FA的变化可以直接反映生物炭添加对餐厨废弃物堆肥效率的影响(见图(2))。两个处理的HA在1～5 d呈上升趋势,在第10天有所下降,在堆肥结束又有所上升;HA的上升可以归因于有机质向HA的转化,HA的下降可能是餐厨废弃物中含有大量的“假腐殖酸”,极其不稳定,易被微生物分解利用。堆肥结束时,BC的HA(17.04 mg/g)比CK(10.57 mg/g)高61.21%(见图2(a))。FA则呈下降趋势,且BC的FA在堆肥过程中几乎始终低于CK(见图2(b))。堆肥结束时,BC的FA(9.21 mg/g)比CK(11.95 mg/g)低2.74 mg/g。微生物可能使易降解的FA向HA转化了[21]。HA/FA的变化趋势与HA一致(见图2(c))。堆肥结束,BC的HA/FA(1.85)比CK(0.88)高110.23%;说明添加生物炭有利于餐厨废弃物堆肥的腐殖化[22]。HA和HA/FA的结果与文献[17]的研究结果一致。在后续研究中,可以考虑延长堆肥周期,以促进前体向HA的转化。

图2 生物炭添加对餐厨废弃物堆肥腐殖酸变化的影响Fig.2 Change of humus during composting with biochar addition

注：CK-1是指1 d时的CK样品,其余类推,图4同。图3 生物炭添加对餐厨废弃物堆肥腐殖酸组分变化的影响Fig.3 Change of humus components during composting with biochar addition

HA被划分为4个组分(见图3(a)),FA被划分为3个组分(见图3(b))。C1、C2、C3、C4代表腐殖酸的组分从简单到复杂,C1易被微生物分解利用,C4组分复杂、较为稳定。1 d时餐厨废弃物堆肥HA的C1占44.79%～49.25%、FA的C1占32.90%～35.13%;餐厨废弃物的腐殖酸以简单组分为主,说明其极易降解。堆肥过程中,C1呈下降趋势,而C3、C4则呈上升趋势。堆肥结束,BC的C4(20.88%)比CK(17.86%)高3.02百分点,这与文献[23]的研究结果一致,说明添加生物炭有利于堆肥腐殖酸复杂组分的形成。

2.3 生物炭添加对堆肥微生物群落演替的影响

堆肥过程中主要的门水平微生物包括厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)(见图4(a)),这与文献[24]的结果一致。厚壁菌门随时间增加呈先上升而随后大体下降的趋势,这可能是厚壁菌门耐受高温导致的。堆肥过程中厚壁菌门的相对丰度在57%以上,显著高于其他微生物。据报道,厚壁菌门是降解复杂有机物的关键菌群[25]。放线菌门的相对丰度大体呈上升趋势,据报道它具有降解木质素的功能,可以促进堆肥腐殖化。

图4 生物炭添加对餐厨废弃物堆肥微生物演替的影响Fig.4 Change of bacterial community evolution during composting with biochar addition

堆肥过程中主要的属水平微生物包括魏斯氏菌(Weissella)、糖单胞菌(Saccharomonospora)、乳酸杆菌(Lactobacillus)、嗜热细菌(Thermobifida)、嗜热放线菌(Thermoactinomyces)、脲杆菌(Ureibacillus)、气单胞菌(Aerococcus)、芽孢杆菌(Bacillus)、好氧芽孢杆菌(Aeribacillus)、葡萄球菌(Staphylococcus)(见图4(b)),这与文献[26]的研究结果一致。魏斯氏菌是堆肥前期的优势菌属,魏斯氏菌会抑制堆肥的腐殖化,后期魏斯氏菌相对丰度减少,对堆肥的抑制作用降低。糖单胞菌、嗜热细菌、嗜热放线菌、脲杆菌是堆肥后期的优势菌属,这些微生物也许与腐殖酸的形成密切相关。添加生物炭对微生物种属差异无影响,但是对其丰度有较大影响;也许添加生物炭可以提升促腐微生物的相对丰度,最终促进堆肥腐殖化。添加生物炭有利于堆肥微生物多样性(Chao1指数)(见图5(a))和丰富度(Shannon指数)(见图5(b))的总体提升。

2.4 促腐微生物分析

将4个时期相对丰度加和>1%的微生物菌属与前体、HA、FA、HA/FA进行Pearson相关性分析。气单胞菌和土地芽孢杆菌(Terribacillus)与HA、HA/FA显著正相关(P<0.05)。堆肥结束时,CK、BC的气单胞菌相对丰度分别为0.20%、0.50%,土地芽孢杆菌相对丰度分别为0.02%、0.06%;说明添加生物炭有利于气单胞菌和土地芽孢杆菌的生长,从而有利于腐殖酸的形成、堆肥的腐殖化。土芽孢杆菌(Geobacillus)和小多孢菌(Micropolyspora)与HA、HA/FA显著负相关(P<0.05)。CK、BC的土芽孢杆菌相对丰度分别为3.59%、2.80%,小多孢菌的相对丰度分别为1.52%、1.36%;说明添加生物炭会抑制土芽孢杆菌和小多孢菌的生长,从而有利于腐殖酸的形成、堆肥的腐殖化。蜡样芽孢杆菌(Cerasibacillus)、巨球菌(Macrococcus)、Tepidanaerobacter与FA、还原糖、氨基酸、多酚显著负相关(P<0.05),CK和BC的蜡样芽孢杆菌相对丰度分别为0.08%、0.09%,巨球菌的相对丰度分别为0.01%、0.02%,Tepidanaerobacter的相对丰度分别为0.02%、0.05%,说明添加生物炭会促进蜡样芽孢杆菌、巨球菌、Tepidanaerobacter的生长,有利于前体向腐殖酸的转化。堆肥结束时促腐微生物相对丰度见图6。

图6 促腐微生物相对丰度Fig.6 Relative abundance of bacteria promoting the formation of humic acid

本次研究主要基于测序分析和Pearson相关性分析识别促腐微生物;在后续研究中,可以通过调控促腐微生物,进而促进堆肥腐殖酸的形成。这些促腐微生物在腐殖酸形成过程中,究竟行使什么样的功能并不知晓,在后续实验中可以进一步研究。

3 结 论

添加生物炭可以促进餐厨废弃物堆肥中气单胞菌、土地芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、巨球菌、Tepidanaerobacter的生长,抑制土芽孢杆菌、小多孢菌的生长,有利于还原糖、氨基酸、多酚向腐殖酸的转化。

本研究揭示了餐厨废弃物堆肥HA不稳定的特征,且证明了添加生物炭可以促进餐厨废弃物堆肥HA中简单组分向复杂组分的转化,这对生物炭在餐厨废弃物肥料化上的应用具有深远意义。