基于网络药理学和分子对接探讨白藜芦醇治疗乙型病毒性肝炎相关性肝癌的作用机制

吴成宪，王益，刘赋斌

武汉科技大学附属天佑医院，湖北 武汉 430000

肝细胞癌已成为世界范围内癌症死亡的主要原因。乙型病毒性肝炎是由于乙型肝炎病毒（HBV）感染导致，可引起个体患肝细胞癌的风险增加[1-2]。既往研究表明，我国是全球乙肝患者数量最多的国家，乙型病毒性肝炎患者的肝脏疾病进展与病毒的活性复制密切相关，发展到一定程度会引发肝细胞癌变[3-5]。这对人类的生存造成了极大的威胁，目前治疗肝癌的主要手段是肝切除术，此外，新辅助治疗、辅助治疗、靶向治疗、免疫治疗等近年来也逐渐兴起。白藜芦醇是一种非黄酮类多酚有机化合物，是许多植物受到刺激时产生的一种抗毒素。既往研究表明葡萄内含有较为丰富的白藜芦醇[6]，而体外实验及动物实验结果显示白藜芦醇有抗氧化、抗炎、抗癌及心血管保护等作用[7-11]。研究表明，白藜芦醇可能通过调节蛋白激酶B（Akt）信号通路来治疗乙型病毒性肝炎相关性肝癌，但其内在机制仍不明确[12-13]。

网络药理学是一门综合了药理学和计算机科学的交叉学科，其基于生物网络平衡原理，用以解释疾病的病理生理过程[14]。通过对广泛数据库的深度挖掘，建立了一个复杂的“药物–靶点–疾病”相互作用网络，着重强调了多靶点和多信号通路的调控机制。这一领域为中西医结合治疗提供了深远的理论指导。本研究运用网络药理学和分子对接技术对白藜芦醇在治疗乙型病毒性肝炎相关性肝癌中的潜在靶点和信号通路进行了预测，并揭示了其可能的作用机制。这些结果为未来的临床应用和深入研究提供了重要的学术支持。

1 材料与方法

1.1 白藜芦醇靶点的筛选

通过数据库PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）得到化合物白藜芦醇化学结构，并保存对应Canonical SMILES 号，将得到的白藜芦醇的SMILES 号分别输入到 Swiss Target Prediction（https://swisstargetprediction.ch）和Target Net 数据库（https://targetnet.scbdd.com）中，种属定义为“Homo sapiens”“probability＞0”，剔除重复靶点后筛选得到白藜芦醇的潜在靶点。

1.2 乙型病毒性肝炎相关性肝癌的靶点筛选

通过GeneCards（https://www.genecards.org）、OMIM（https://www.omim.org）、DisGeNET（https://www.disgenet.org/）数据库对关键词“hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma”进行检索，种属定义为“Homo sapiens”“score＞0”，剔除重复靶点后筛选得到乙型病毒性肝炎相关性肝癌的潜在靶点。

1.3 “药物–疾病–靶点”网络分析

将数据库预测的白藜芦醇的靶点和乙型病毒性肝炎相关性肝癌的靶点分别上传到Venny 2.1.0平台（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），得到白藜芦醇和乙型病毒性肝炎相关性肝癌的交集靶点，并绘制白藜芦醇与乙型病毒性肝炎相关性肝癌的交集靶点韦恩图。

1.4 蛋白相互作用（PPI）网络构建与分析

将筛选出的白藜芦醇与乙型病毒性肝炎相关性肝癌交集靶点，导入STRING 数据库（https://string-db.org），种属定义为“Homo sapiens”进行分析，构建交集靶点的PPI 网络，其阈值取“medium confidence”得到靶蛋白相互作用的核心网络关系，将结果导出为TSV 格式并导入Cytoscape 3.7.2 软件包，进一步绘制药物靶蛋白和疾病PPI 网络图。通过网络拓扑分析插件（Cytohubba）进行拓扑分析和计算，得到各个靶点的degree 值，筛选得到排名前10 名的靶标蛋白为核心靶点。

1.5 基因本体（GO）和京都基因组百科全书（KEGG）富集分析

为了解释核心靶点对基因功能的影响，将以上选取的白藜芦醇和乙型病毒性肝炎相关性肝癌交集靶点导入Metascape 数据库（https://metascape.org）中，以P＜0.05 为筛选条件，获得了对应的GO和KEGG 通路富集的结果，进一步使用“微生信”平台对GO 分析与KEGG 富集分析进行可视化。随后进行“药物–靶点–通路”互作网络的建立。

1.6 分子对接

通过进一步在 PubChem 数据库 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）检索获取白藜芦醇的3D结构式。在PDB 数据库（https://www.rcsb.org）将前10 位核心靶点的PDB 格式进行下载。使用Pymol软件对核心靶点去水和去配体，并保存。利用Autodock 软件将degree 值前10 位核心靶点分别与白藜芦醇进行分子对接，将对接结果导入PyMOL进行可视化。

2 结果

2.1 白藜芦醇药物靶点及乙型病毒性肝炎相关性肝癌疾病靶点的获取

从Swiss Target Prediction 与Target Net 数据库得到白藜芦醇相关基因496 个；从GeneCards、OMIM、DisGeNET 数据库筛选得到乙型病毒性肝炎相关性肝癌的基因整合去重后得到1 018个基因。

2.2 白藜芦醇药物靶点及乙型病毒性肝炎相关性肝癌疾病交集靶点的获取

将得到的白藜芦醇与乙型病毒性肝炎相关性肝癌靶点取交集并绘制韦恩图，得到交集靶点48个，见图1。

图1 白藜芦醇与乙型病毒性肝炎相关性肝癌靶点Venn 图Fig.1 Venn diagram of resveratrol and hepatitis B virusrelated liver cancer targets

2.3 PPI 网络分析及关键靶点筛选

在STRING 网站中提交白藜芦醇–乙型病毒性肝炎相关性肝癌交集靶点进行PPI 网络构建，物种选择为“Home Sapiens”和“P＜0.05”，隐藏在网络图中未连接的点，最低置信度为0.400，见图2。导出为“tsv”格式文件，将其导入Cytoscape 3.7.2 软件，对PPI 网络进行可视化，然后使用Cytoscape 中的Cytohubba 进行拓扑参数分析，degree 值越高表示该节点在所有靶点中越重要，取degree 值前10位的靶点为关键靶点，依次为肿瘤坏死因子（TNF）、基质金属蛋白酶9（MMP9）、表皮生长因子受体（EGFR）、B 细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、趋化因子C-XC-基元受体4（CXCR4）、热休克蛋白90α 家族A类成员1（HSP90AA1）、热休克蛋白90α 家族B 类成员1（HSP90AB1）、前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）、激酶插入区受体（KDR）、雌激素受体α（ESR1），见图3。

图2 交集靶点的PPI 网络Fig.2 PPI network of intersection targets

图3 基于degree 算法排名前10 位的核心靶点Fig.3 Top 10 core targets based on degree algorithm

2.4 GO 和KEGG 通路富集分析

将白藜芦醇药物靶点及乙型病毒性肝炎相关性肝癌疾病交集靶点导入Metascape 数据库，设定P＜0.01 为筛选条件，分别进行GO 分析与KEGG富集分析，得到446 个分子功能（MF）、3 148 个生物过程（BP）、285 个细胞组分（CC）和205 条信号通路，其中MF 前8 位的分别是C-C 趋化因子受体活性、一氧化氮合酶调节子活性、内肽酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白结构域特异性结合、泛素蛋白连接酶结合、病毒受体活性、转录共激活因子结合。BP 前8 位分别是磷代谢过程的正调控、细胞迁移的正向调控、对无机物的响应、对激素的反应、第二信使介导的信号、管的形态发生、细胞对脂质的反应、组织形态发生。CC 前8 位分别是质膜外侧、膜筏、胞体、细胞投射膜、细胞外基质、黏着斑、核膜、内质网腔。

KEGG 富集分析以P值由小到大的顺序排列，结果癌症中的通路、脂质与动脉粥样硬化、前列腺癌、癌症中的蛋白聚糖、趋化因子信号通路、白细胞介素（IL）-17 信号通路、人巨细胞病毒感染、人类免疫缺陷病毒1 型感染、糖尿病并发症中的晚期糖基化终末产物–晚期糖基化终末产物受体（AGERAGE）信号通路；缺氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路等。使用“微生信”平台对GO、KEGG 富集分析得到的结果绘制气泡图，见图4。进一步绘制“药物–靶点–通路”互作网络，见图5。

图5 “药物–靶点–通路”互作网络Fig.5 “Drug– target -pathway”interaction network

2.5 分子对接分析

对Cytoscape 使用拓扑分析得到的10 个关键靶标TNF、MMP9、EGFR、Bcl-2、CXCR4、HSP90AA1、HSP90AB1、PTGS2、KDR、ESR1，分别和白藜芦醇进行分子对接，对接结合能均小于0，结合能越小则越容易结合，结合能越小配体与靶点之间的结合越稳定，对接结合能见表1。利用Autodock4 导出的对接化合物结果导入Pymol 中，利用Pymol 对化合物进行分子三维展示，见图6。

表1 核心靶点的分子对接结合能Table 1 Molecular docking binding energy of core targets

图6 白藜芦醇与关键靶点的分子对接三维示意图Fig.6 3D schematic diagram of molecular docking of resveratrol with key targets

3 讨论

白藜芦醇是多酚类型化合物的一种，其具有抗癌、抗菌、抗炎等药理作用[15]，既往的研究表明，白藜芦醇具备多种影响癌细胞生物学行为的特性，包括对癌细胞的增殖、凋亡和血管生成过程的干预，这些作用可显著地抑制多种肿瘤的发展[16-17]。此外，白藜芦醇还能够逆转癌细胞对多种药物的耐药性；当与临床药物联合使用时，白藜芦醇不仅能够提高癌细胞对化疗药物的敏感性[18-19]，还以剂量相关性的方式刺激淋巴细胞减少、IL-2 的释放，增加IL-4 的分泌，从而进一步增强抗癌治疗效果[20]。本研究基于网络药理学研究白藜芦醇对乙型病毒性肝炎相关性肝癌的潜在作用机制，完成了药物及疾病的靶点筛选、PPI 分析、功能富集分析、药物–疾病–靶点–通路分析、分子对接模型的构建。利用生物信息学数据库，确定了48 个白藜芦醇治疗乙型病毒性肝炎相关性肝癌的靶基因，这表明白藜芦醇对乙型病毒性肝炎相关性肝癌具有一定的抗癌作用。通过Cytoscape 的拓扑分析显示，TNF、

MMP9、EGFR、Bcl-2、CXCR4、HSP90AA1、HSP90AB1、PTGS2、KDR、ESR1 为白藜芦醇对乙型病毒性肝炎相关性肝癌作用的关键靶点。既往的研究表明白藜芦醇通过调节TNF-β 信号通路，从而抑制MMP9、CXCR4 在肿瘤细胞中的激活[21-22]。此外，NK 细胞通过释放TNF-α 等抗癌细胞因子来诱导肿瘤细胞凋亡[23]，而白藜芦醇能增强NK 细胞的活性及抗癌能力[24]。EGFR 过度活化会引起磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt 信号通路的过度活化，从而引起肿瘤细胞的增殖[25]。在体外实验中，白藜芦醇处理人子宫癌细胞系（HeLa）细胞，发现HeLa 细胞中EGFR 显著下调[26]，这表明白藜芦醇能够下调EGFR 从而抑制肿瘤细胞的增殖。有研究表明，白藜芦醇能够增加肿瘤蛋白p53 与p53 靶基因的表达，其中就包括了Bcl-2[27-28]，从而促进肿瘤细胞的凋亡[29]。既往的研究表明，白藜芦醇具有抗肿瘤作用，而热休克蛋白（HSP）的缺失，能够增强白藜芦醇对癌细胞的促凋亡作用[30]，相反HSP 的激活反而能够抑制细胞凋亡[31]。Che 等[32]研究表明，白藜芦醇通过降低PTGS2 从而抑制肝细胞癌的进展和促进细胞凋亡。Kiamehr 等[33]的研究表明低剂量的白藜芦醇可促进血管生成，而高剂量的白藜芦醇会抑制VEGFR-2 磷酸化、抑制肿瘤血管生成、诱导肿瘤细胞凋亡。有研究表明，在人肝癌样本中ESR1 的表达上调，而在体外使用白藜芦醇处理人肝癌细胞发现ESR1 表达下调，这提示ESR1可能作为白藜芦醇发挥抗肝癌的药物靶点[34]。

GO 功能富集分析显示，交集靶点主要参与的BP 包括磷代谢过程的正调控、细胞迁移的正向调控、对无机物的响应；参与的MF 主要包括C-C 趋化因子受体活性、一氧化氮合酶调节子活性、内肽酶活性等；CC 主要包括质膜外侧、膜筏、胞体、细胞投射膜、细胞外基质等。KEGG 富集通路分析显示，白藜芦醇治疗乙型病毒性肝炎相关性肝癌的主要作用通路包括癌症中的通路、脂质与动脉粥样硬化、前列腺癌、癌症中的蛋白聚糖、趋化因子信号通路、IL-17 信号通路等。蛋白聚糖在癌症血管生成、增殖、侵袭和转移中起着重要作用[35]，此外，蛋白聚糖通过影响细胞代谢、调节细胞生长和凋亡信号、促进细胞侵袭和参与免疫破坏的作用来促进肝癌的发生与发展[36]。趋化因子在先天性与适应性免疫中起积极作用，其由CXC、CC、C 或CX3C 亚型组成[37]，CXCR4 常常在恶性肿瘤中过度表达，CXCRL12/CXCR4 轴通过调节血管生成，诱导上皮间充质转化，从而促进癌症的进展与转移[38]。近来越来越多的研究表明IL-17 在癌症的形成中起重要作用[39]，其中的IL-17A 是一种促进肿瘤生长的细胞因子，有研究表明IL-17A 阻断剂可预防高危患者发生肝细胞癌[40-41]。有学者提出，IL-17 同样能通过促进组织慢性炎症来加快肿瘤的发生与发展[42]。在动物实验中，人巨细胞病毒（CMV）能够限制肿瘤细胞增殖并增强肿瘤细胞凋亡，此外，有很多的实验模型发现，CMV 感染能够减缓肿瘤细胞增殖并促进内在半胱天冬酶癌细胞凋亡[43]，1 项研究中同样发现在肝癌患者接受肝移植后，CMV 感染能够降低肝癌的复发风险[44]。在人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）感染患者中，常常伴随着HBV 感染，是肝细胞癌发生的最重要危险因素[45]。AGE 与其受体RAGE 结合能增加氧化应激和炎症反应，这共同促进肿瘤的发生[46]。此外，AGEs-RAGE 信号通路通过对细胞凋亡的负反馈调节和对自噬、坏死性凋亡等促生存机制介导的DAMPs 释放来促进癌细胞的生长[47]。HIF-1 是在缺氧癌细胞中代谢重编程的关键调节剂，癌细胞在缺氧状态下发生代谢重编程，进而促进肿瘤细胞的存活与增殖[48]。

分子对接结果显示，白藜芦醇与核心靶点（TNF、MMP9、EGFR、Bcl-2、CXCR4、HSP90AA1、HSP90AB1、PTGS2、KDR、ESR1）具有良好的对接活性，这表明白藜芦醇可能是通过作用于TNF、BCL2、CXCR4、EGFR 等核心靶点来调节AGERAGEs 信号通路、IL-17 信号通路、HIF-1 信号通路、趋化因子通路等多条信号通路来发挥治疗乙型病毒性肝炎相关性肝癌的作用。

综上，通过网络药理学与分子对接的方式，预测了白藜芦醇治疗乙型病毒性肝炎相关性肝癌多靶点、多通路的机制，总结出白藜芦醇可能通过TNF、BCL2、CXCR4、EGFR 等多个靶点，调节AGERAGE 信号通路、IL-17 信号通路、HIF-1 信号通路、趋化因子通路等多条信号通路，进而抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤血管生成、促进肿瘤细胞凋亡等来发挥治疗乙型病毒性肝炎相关性肝癌的作用。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突