3-芳基取代脯氨酸的合成

＊冉冬梅 吴谭林 刘伊琳 冯若昆

（绍兴文理学院化学化工学院 浙江 312000）

近年来，氨基酸作为组成多肽的重要结构单元而被广泛应用于小分子药物的合成中[1]，越来越多的生物制剂如多肽、蛋白质以及单克隆抗体被应用于临床医学中，在医疗和保健方面发挥着越来越重要的作用[2-4]。脯氨酸是一种重要的环状氨基酸，由脯氨酸合成的多肽相较于由直链氨基酸合成的多肽，其不仅可以增加多肽的细胞膜渗透性还可以抵御蛋白质水解作用[5]。另外脯氨酸也是重要的手性催化剂以及配体[6-8]，在不对称有机合成中发挥着重要的作用。3-芳基取代的脯氨酸根据其取代基的不同，可以直接影响其合成药物的生物活性[9]，如图1所示，I是一种黑素皮质激素-4受体（MC4R），II是一种单胺再攫取抑制剂[10]，研究发现前者具有减轻体重和减少食物摄入的功效，还可以用于治疗癌症恶化等病症。此外，近期的研究还表明其对治疗焦虑和抑郁有奇效[11]。因此研究3-取代脯氨酸的合成新方法，拓展该类化合物的合成，具有相当重要的科研意义和广泛的应用价值。

图1 含有3-芳基取代脯氨酸的药物分子结构

传统合成3-芳基取代脯氨酸的方法主要为分子间环化法[10]，该反应路线不仅反应原料昂贵不易得、反应步骤较长、反应效率较低，而且产物的手性难以控制，探索发展简便、快捷、高效的合成3-取代脯氨酸的方法显得非常重要。

近年来，由于过渡金属催化的碳氢键活化反应与传统偶联反应相比具有明显的优势，而受到科研工作者的青睐。随着研究的深入，基于该方法的各种偶联反应在合成天然产物、药物分子及有机材料方面取得了极大的发展。结合本课题组及Bull课题组在钯催化的脯氨酸碳氢键官能化反应的研究[12]，本文拟利用碳氢键活化的方法，以脯氨酸为母体，通过在脯氨酸上引入相应的导向基团和保护基团实现脯氨酸3-位的碳氢键芳基化反应，而后，利用简便的方法一步实现引入基团的脱除，高效地制备相应的3-芳基取代的脯氨酸化合物，并对其生物活性进行初步探索。

1.实验部分

(1)主要仪器与试剂

DF-101S型集热式恒温磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）；400MHz核磁共振谱仪（TMS为内标，瑞士Bruker公司，AVANCE Ⅲ）。

脯氨酸，8-氨基喹啉，碘苯，对甲基碘苯，对氯碘苯，对氟碘苯，对溴碘苯，3,4-二氯碘苯，3,4-二氟碘苯，2-碘吡啶，2-碘噻吩；乙醇，二氯甲烷，石油醚，乙酸乙酯。

(2)实验方法

①3-芳基-2-(喹啉-8-基氨基甲酰基)-吡咯烷-1-甲酸苄基酯（3aa-3ai）的合成

称取2-(喹啉-8-基氨基甲酰基)-吡咯烷-1-甲酸苄基酯（0.5mmol）、碘代芳烃（1.0mmol）、醋酸银（1.0mmol）、醋酸钯（5mol%）加入到厚壁耐压管中，用0.25mL甲苯作为反应溶剂并放入小磁子，在110℃油浴中搅拌反应24h后冷却至室温。加入10mL乙酸乙酯到反应液中，然后用硅藻土过滤并用20mL乙酸乙酯洗脱两次，合并滤液在减压条件下用旋转蒸发仪除去溶剂得到粗物质。将粗物质通过快速色谱柱纯化得到纯化合物。

②3-芳基取代脯氨酸的合成

称取上述产物（0.2mmol）、氢氧化钠（4mmol）加入到厚壁耐压管中，用2mL乙醇作反应溶剂，加入小磁子在100℃油浴中搅拌混合直至反应物反应完全。然后待反应液冷却至室温加入30mL二氯甲烷稀释，再加入30mL水。分离出二氯甲烷有机层，再往剩余的水层中加入稀盐酸直至pH=1。用二氯甲烷萃取剩余水相，合并二氯甲烷有机相用无水硫酸镁干燥0.5h以上并过滤，然后将滤液用旋转蒸发仪在减压条件下除去溶剂得到纯3-芳基取代脯氨酸固体。

(3)实验数据

3-苯基脯氨酸（86%）：1H NMR(D2O,400Hz)δ2.02～2.15(m,1H),2.34～2.42(m,1H),3.33～3.52(m,3H),4.25～4.27(m,1H),7.22～7.30(m,5H)。

3-对甲苯基脯氨酸（88%）：1H NMR(D2O,400Hz)δ2.21(m,1H),2.34(m,3H),2.50(m,1H),3.56～3.67(m,3H),4.31(m,1H),7.32(m,4H)。

3-对氟苯基脯氨酸（78%）：1H NMR(D2O,400Hz)δ2.33～2.41(m,1H),2.63～2.69(m,1H),3.62～3.69(m,1H),3.75～3.83(m,2H),4.48～4.51(m,1H),7.27～7.31(m,2H),7.55～7.58(m,2H)。

3-对氯苯基脯氨酸（81%）：1H NMR(D2O,400Hz)δ2.33～2.41(m,1H),2.64～2.69(m,1H),3.64～3.68(m,1H),3.75～3.83(m,2H),4.49～4.65(m,1H),7.51～7.57(m,4H)。

3-对溴苯基脯氨酸（82%）：1H NMR(D2O,400Hz)δ2.32～2.40(m,1H),2.62～2.68(m,1H),3.64～3.68(m,1H),3.73～3.81(m,2H),4.43～4.64(m,1H),7.60～7.68(m,4H)。

3-(3,4-二氯苯基)脯氨酸（69%）：1H NMR(D2O,400Hz)δ2.02～2.13(m,1H),2.36～2.44(m,1H),3.33～3.40(m,1H),3.48～3.55(m,2H),4.32～4.54(m,1H),7.15～7.18(m,1H),7.39(d,J=8.4Hz,1H),7.44～7.18(m,1H)。

首先给拐杖终端接上电源,当卫星导航数据有效后,LCD液晶显示屏上显示当前的时间、空间信息,并同时显示测得的体温信息以及心率信息,同时会将信息传递至远程的手机端软件上。

3-(3,4-二氟苯基)脯氨酸（73%）：1H NMR(D2O,400Hz)δ2.12～2.16(m,1H),2.36～2.44(m,1H),3.35～3.42(m,1H),3.50～3.56(m,2H),4.26(d,J=10.0Hz,1H),7.15～7.18(m,1H),7.39(d,J=8.4Hz,1H),7.44-7.18(m,1H)。

3-(2-噻吩基)脯氨酸（82%）:1H NMR(D2O,400Hz)δ2.22～2.29(m,1H),2.47～2.56(m,1H),3.44～3.51(m,1H),3.55～3.61(m,1H),3.90～3.96(m,1H),4.23～4.25(m,1H),7.00～7.02(m,1H),7.07～7.08(m,1H),7.35～7.36(m,1H)。

3-(2-吡啶基)脯氨酸（5 6%）:1H N M R(-D2O,400Hz)δ2.48～2.81(m,3H),3.60～3.74(m,2H),4.09～4.23(m,1H),8.00～8.12(m,2H),8.61～8.76(m,1H),9.14～9.23(m,1H)。

2.结果与讨论

(1)反应底物筛选

研究表明，保护基团和导向基团是影响脯氨酸直接碳氢键官能化反应的关键因素，因此，在研究之初首先要对脯氨酸上引入的基团进行筛选。根据本课题组前面的工作，发现8-氨基喹啉作为导向基团时，反应具有较高的产率，而且该基团易于脱除。而对于保护基团来说，如图2所示，当分别使用氯甲酸苄酯（Cbz-Cl），芴甲氧羰酰氯（Fmoc-Cl），二碳酸二叔丁酯（Boc2O）以及特戊酰氯（Piv-Cl）作为脯氨酸氨基的保护基团时，发现当使用特戊酰氯作为保护基团时反应产率最高为71%。然而特戊酰氯作为保护基团时，产物在后续保护基团的脱除时所用条件较为苛刻，而且得到的产物为三氟乙酸的盐不易于产品纯化。虽然N-Cbz保护的脯氨酸原料发生芳基化反应时产率较低，但是Cbz易于脱除，而且条件简便，有利于该反应的拓广。因此，选用Cbz作为保护基团，通过对反应催化剂，氧化剂以及溶剂的优化得到较佳的反应条件，从而合成一系列3-芳基取代的脯氨酸。

图2 保护基团的影响

(2)3-芳基取代脯氨酸的合成

经过条件优化，发现当降低甲苯的用量时，反应产率呈上升趋势，当甲苯的用量降低到0.25mL时，产率最高，达到83%。在得到最佳反应条件后，合成了一系列3-芳基脯氨酸衍生物，如图3所示。

图3 脯氨酸衍生物3-芳基脯氨酸的合成

(3)3-芳基取代脯氨酸细胞毒性考察

①细胞培养。A549和NCI-H460人非小细胞肺癌细胞购于中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。细胞培养于添加了胎牛血清（10%，v/v）、NaHCO3（2g/L）、谷氨酸（2mM）、青霉素（100kU/L）、链霉素（100kU/L）的RPMI-1640培养基中，在5% CO2含量及37℃的恒温培养箱中培养。

③细胞毒活性结果。以A549和NCI-H460人非小细胞肺癌细胞为模型，采用MTT法评价了合成的3-芳基取代脯氨酸化合物的细胞毒活性。从细胞生长曲线可以看出，化合物作用48h后，A549和NCI-H460细胞的存活率均呈现出浓度依赖的降低，但几种化合物的IC50值均大于400μM，如图4所示，这暗示着其具有低的细胞毒性。

图4 细胞毒性测试

3.结论

本文利用过渡金属催化的碳氢键活化反应，通过在脯氨酸母体上引入保护基团及导向基团，从而实现脯氨酸3-位的碳氢键活化芳基化反应，合成了3-芳基取代的脯氨酸衍生物，而后通过一步反应脱除引入基团，简便快捷高效地实现了3-芳基取代脯氨酸的合成，并对该类化合物的细胞毒性进行了考察。此外，本课题组还在探索此类化合物的其他生物活性。