酶联免疫吸附和胶体金技术对黄曲霉毒素M1检测的结合验证

乔 宽，王路阳，王艳飞，张云鲜，时长旭

蒙牛乳业（焦作）有限公司，河南焦作 454100

0 引言

黄曲霉毒素（AFT）是黄曲霉和寄生曲霉等某些菌株产生的双呋喃环类毒素。其衍生物有约20 种，分别命名为B1、B2、G1、G2、M1、M2、GM、P1、Q1、毒醇等。其中B1的毒性最大，致癌性最强。动物食用黄曲霉毒素污染的饲料后，在肝脏、肾脏、肌肉、血液、乳汁及蛋品中可测出极微量毒素[1]。黄曲霉毒素M1（Aflatoxin M1，AFM1）是动物摄入黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）后在体内经羟基化形成的代谢产物，毒性仅次于AFB1，WHO将其列为ⅡB类致癌物。AFM1主要存在于动物的乳汁、肾脏、肝脏、蛋、肉和尿中，以乳中最常见。牛乳及其制品是易受黄曲霉毒素污染的食品之一[2，3]。若把发霉谷物作为饲料饲喂动物，其中的黄曲霉毒素在24 h之后就能进入乳中。黄曲霉毒素被动物食用后，一部分会蓄积在体内，另外一部分会转化到乳汁和尿液中，转化率一般为3.45%～11.39%，排出AFM1的量为AFB1摄入量的1%～3%。黄曲霉毒素M1进入人或动物体内后，除抑制DNA、RNA合成外，也抑制肝脏蛋白质合成，导致人体中毒。其危害主要表现在3 个方面：一是损害组织器官；二是致癌、致畸、致突变，引发动物及人类的肝癌、肾癌和胃癌等；三是抑制免疫机能。其毒性是氰化钾的10倍，砒霜的68 倍，主要危害部位是肝脏。我国规定生牛乳中黄曲霉毒素M1含量不得超过0.5 µg/kg[4]。近年来，由于国内外乳品安全问题，作为乳品中广泛存在的一类剧毒物——黄曲霉毒素越发引起关注。黄曲霉毒素具有强烈致癌性、致畸性及诱变性，已被证实可对人和动物健康造成极大伤害，牛乳中以其代谢产物黄曲霉毒素M1最常见。

本文阐述牛乳中黄曲霉毒素M1的来源与危害，并重点介绍2 种检测方法的对比分析。当前，我国检测机构针对生牛乳中AFM1检测设备有很多种，涉及检测原理主要有同位素稀释液相色谱—串联质谱法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附筛查法、胶体金法等。在AFM1检测中根据不同需求，选择不同设备和方法检测，对检测效率至关重要，因此，本文通过试验对酶联免疫吸附筛查法、胶体金法对生牛乳中AFM1的进行对比分析，旨在为乳品企业选择牛乳中AFM1检测方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

酶标仪ELx800，美国伯腾仪器有限公司生产；胶体金读数仪OTplus-Ⅱ，北京陆桥技术股份有限公司生产；ME204E/02电子天平，梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司生产；高速冷冻离心机Neofuge15R，上海力申科学仪器有限公司生产；振荡器MS3 basic，德国IKA Works GmbH & Co.KG生产；保鲜柜LSC-600K，浙江星星冷链集成股份有限公司生产；黄曲霉毒素M1灵敏检测试剂盒，丹麦普格生物技术股份有限公司生产；黄曲霉毒素M1金标快速检测条，北京陆桥技术股份有限公司生产；去离子水。

1.2 样品前处理

1.2.1 酶标仪

吸取1.0 mL液体生乳样品于离心管中，2～8 ℃、3 000 r/min离心10 min，去除脂肪层，吸取100 L脱脂牛奶样品进行检测。

1.2.2 胶体金读数仪

生乳样品回温至20～25 ℃。混匀后直接检测。

1.3 仪器检测原理对比

1.3.1 酶标仪检测原理

该产品基于竞争性酶联免疫吸附测定原理。酶标板微孔包被有AFM1特异性抗体。AFM1标准品和待测样品加入酶标微孔中，若AFM1存在，溶液中AFM1会与包被的抗体偶联。未偶联的AFM1将在洗涤步骤中洗去。之后将AFM1-HRP酶结合物（检测溶液）加入酶标板微孔中。AFM1-HRP酶结合物与还未被标准品或样品中AFM1占据的抗体结合部位偶联。检测溶液中所有未偶联的AFM1-HRP酶结合物将在洗涤步骤中洗去。将显色底物加入微孔中，与检测出的抗体逐渐形成蓝色络合物。显色过程在加入酸后停止，并将生成的最终物质变成黄色。450 nm下测定吸光值，有色络合物的光强度与样品、标准品中AFM1浓度间接成比例。

1.3.2 胶体金读数仪检测原理

应用竞争性免疫层析检测原理，通过受检样品中AFM1与固定在检测线上的AFM1竞争结合标记有胶体金颗粒的抗体，达到抑制检测线显色效果。

1.4 仪器检测

1.4.1 酶标仪

（1）使用前将所有试剂恢复至20～25 ℃，将所需数量的板条固定在微孔板架上，记录标准品和样品位置。

（2）将100 µL标准品或样品加入对应微孔中，封板，摇板30 s，室温下温育45 min。

（3）将孔内液体甩干，在吸水纸上拍干，加入稀释后的洗涤液250 µL/孔到微孔中，重复洗涤4 次，每次间隔10 s。如使用自动洗板机，可预定洗板完成5次周期，用吸水纸拍干（拍干后未清除气泡可用干净的枪头刺破）。

（4）加入100 µL AFM1检测溶液，封板，摇板30 s后，室温下温育15 min。

（5）重复步骤3，将孔内液体甩干，在吸水纸上拍干，加入稀释后的洗涤液250 µL/孔到微孔中，重复洗涤4 次，每次间隔10 s。如使用自动洗板机，可预定洗板完成5 次周期，用吸水纸拍干（拍干后未清除气泡可用干净的枪头刺破）。

（6）加入100 µL TMB基底，封板，摇板30 s后，于室温下暗处避光温育15 min。

（7）移去封板膜，在每个微孔中加入100 µL终止液，摇板，设定酶标仪于450 nm处（在5 min内读完数据）测定每孔OD值。用spline曲线进行计算。

1.4.2 胶体金读数仪

（1）试验前请将试纸条和待测样本恢复至20～25 ℃。

（2）用移液器移取200 µL待测生乳样品于微孔中，反复吹打直至微孔中红色试剂充分溶解混匀后，将其放置于（40±1）℃温育器上温育3 min。

（3）将试纸条插入微孔中，（40±1）℃温育器上继续温育7 min，温育结束后取出试纸条，去除下端样品垫，判读结果。

2 结果与分析

2.1 酶标仪和胶体金读数仪的检测试验对比

将10 个AFM1定性检测为阳性的生乳样本，分别用酶标仪和胶体金读数仪检测，其中酶标仪检测采用加标回收率方法，胶体金读数仪检测采用阳性质控样方法，按照正常试验步骤进行前处理和检测。2 种方法检测结果见表1、表2。其中表1的本底样为不含待检物质的复原乳，表2的本底样为不含待检物质的生牛乳。

表1 酶标仪检测样本数据结果

表2 胶体金读数仪检测样本数据结果

根据《牛乳中黄曲霉毒素M1的快速检测 双流向酶联免疫法》（NY/T 1664—2008）、《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）、《食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素M族的测定》（GB 5009.24—2016）、《商品化食品检测试剂盒评价方法》（SN/T 2775—2011），以及表1、表2数据可知，酶标仪检测和胶体金读数仪检测均满足检测要求（其中胶体金读数仪的结果报出只有阴性或阳性的定性结果），酶标仪检测方法的回收率和胶体金读数仪检测方法精密度均达标[5]。

2.2 不同设备的使用对比分析

对2 种设备在单位样品检验时间、费用、操作等方面进行综合比较，结果见表3。2 种检测设备各有优劣，检测机构、企业或检验人员可综合考量自身不同需求和环境、样品量等因素，选择最合适设备进行检验。

表3 酶标仪与胶体金读数仪检测结果比较

3 结论

本文主要对酶标仪、胶体金读数仪检测牛乳中黄曲霉毒素M1的操作过程和检测结果对比分析。从操作过程看，酶标仪检测操作过程相对复杂，所需耗材成本较高，因其试剂较多，操作暴露风险较大，有安全隐患，但快速、灵敏、对样品纯度要求不高，特别适用于大批量样品检测。由于需要酶标仪和熟练操作人员，不适合现场快速检测[6]。胶体金读数仪操作较简单，所用耗材较少，检测过程较安全，检测速度较快，人员水平要求较低。从检测结果看，酶标仪、胶体金读数仪检测方法均满足检测要求。酶标仪检测方法的回收率、胶体金读数仪检测方法精密度均达标。酶标仪检测结果较准确，适合作为定性初筛阳性样品的再次定量验证。胶体金读数仪检测速度较快，但无法定量检测，较适用于快速定性检测。实际应用中，2 种方法可配合使用，灵活运用设备优势，高效率完成工作。