香葱提取液对香肠中亚硝酸盐的影响

丁楠，何星璐，邸佳妮

锦州医科大学食品与健康学院（锦州 121001）

众所周知，腌腊肉制品是我国一种传统且受众广泛的肉制品，但在腌腊肉制品中需要加入亚硝酸盐的量也比其他种类的食品要多一些[1]。从健康角度考虑，不应长期食用亚硝酸盐含量高的食品，否则会增加亚硝酸盐的中毒和患癌的风险，对人体不利。在现代食品加工的研究上，研究人员想方设法减少亚硝酸盐摄入或是找到其代替品，然而根据已查阅到的文献及科研前沿的研究成果显示，尚无法找到完全代替亚硝酸盐的物质。根据已有研究成果可知，利用果蔬能起到清除亚硝酸盐的作用[2]，但是如果将其直接应用在腌腊肉制品中，效果却不一定能够达到期望值，因为对于大多数果蔬而言，它们本身具有一定特殊的气味，这些气味如果残留在腌腊肉制品中会对腌腊肉制品的风味产生消极影响。因此，有科研工作者将研究目光转向农产品。特别是主要用于调味的农产品，如有大葱[3]、洋葱、蒜[4]、姜[5]等，但是已有文献却发现少有人研究香葱是否能够在一定程度上清除亚硝酸盐。

香葱也叫细香葱，在南方地区如广西、云南、广东等地区常见用于调味，在北方地区少见。香葱隶属葱属（Allium）植物，在葱属植物中黄酮类化合物等功能活性成分含量较高，所以葱属植物表现出抗血小板凝集、抗氧化等功能活性[6]。且有研究报道，黄酮对食品中的亚硝酸盐具有一定抑制或清除作用[7]。又由于香葱含有这些物质，所以香葱也应具有清除亚硝酸盐的能力，且将香葱提取液加入香肠中去除亚硝酸盐的研究还未见报道。因此，试验研究在不同条件下香葱提取液对于香肠中亚硝酸盐的清除能力。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验原料

双汇火腿肠、细香葱（均为市售）。

1.1.2 试验试剂

对氨基苯磺酸、亚硝酸钠、无水乙醇、硼酸钠、乙酸锌、盐酸萘乙二胺、盐酸、亚铁氰化钾（均为分析纯）。

1.1.3 试验设备

AXM分析天平（上海精密科学有限公司）；HMU台式离心机（长沙英泰仪器有限责任公司）；UV-5100紫外可见光分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；TU-53水浴锅（精科华瑞仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 细香葱提取液的制备

取100 g经过初步处理并研磨好的细香葱，向其中加入200 mL蒸馏水，搅拌过滤后，静置一段时间，吸取上清液，离心10 min，取上层清液，得到滤液，备用。

1.2.2 样品的制备

称取5 g经过处理呈碎末状的火腿肠，放入烧杯中，与饱和硼砂溶液搅拌均匀，再加入300 mL 70 ℃的温水，移入500 mL容量瓶定容，在沸水浴中加热15 min，冷却至室温。先后加入亚铁氰化钾和乙酸锌溶液来沉淀蛋白，放置0.5 h后去除上层脂肪，用滤纸滤去上清液，最终制得滤液，备用[1]。

1.2.3 亚硝酸盐清除率的测定

选择一个50 mL容量瓶，向其中加入2 mL火腿肠样品液、一定体积的香葱提取液及相应的各种试剂，测吸光度并按式（1）计算清除率。

式中：Ax为不同香葱提取液的用量或不同水浴时间或不同pH或不同水浴温度或不同反应时间下的吸光度；A0为空白试验组的吸光度。

1.3 单因素试验

1.3.1 香葱提取液用量对清除亚硝酸盐的影响

在水浴温度90 ℃、反应pH 12、水浴时间10 min、反应时间10 min条件下，设香葱的提取液用量1，2，3，4和5 mL，在此条件下按照试验方法中的步骤操作，测定亚硝酸盐的清除率。

1.3.2 水浴温度对香葱提取液清除亚硝酸盐的影响

在反应pH 12、水浴时间10 min、香葱提取液3 mL、反应时间10 min条件下，设水浴温度55，65，75，85和95 ℃，在此条件下按照试验方法中步骤操作，测定亚硝酸盐清除率。

1.3.3 反应pH对香葱提取液清除亚硝酸盐的影响

在水浴温度85 ℃、香葱提取液3 mL、水浴时间10 min、反应时间10 min条件下，设反应pH 9，10，11，12和13，在此条件下按照试验方法中步骤来操作，测定亚硝酸盐清除率。

1.3.4 水浴时间对香葱提取液清除亚硝酸盐的影响

在水浴温度85 ℃、反应pH 12、反应时间10 min、香葱提取液3 mL条件下，设水浴时间5，10，15，20和25 min，在此条件下按照试验方法中操作，测定亚硝酸盐清除率。

1.3.5 反应时间对香葱提取液清除亚硝酸盐的影响

在水浴温度85 ℃、反应pH 12、香葱提取液3 mL、水浴时间15 min条件下，设反应时间5，10，15，20和25 min，在此条件下按照试验方法中步骤来操作，测定亚硝酸盐清除率。

1.4 响应面试验设计

在单因素试验基础上选出影响因子最大的3个因素，在此基础上得出响应面Box-Behnken试验设计，以香葱提取液用量（A）、水浴温度（B）、反应时间（C）为影响因子，亚硝酸盐清除率（Y）作为响应值，进行三因素三水平的响应面优化试验，试验因素与水平见表1。

表1 响应面试验因素水平表

1.5 数据处理

试验数据重复3次，作图分析及数据处理采用的软件有Origin 2021软件、Office和Design-Expert 13软件。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 香葱提取液用量对清除亚硝酸盐的影响

由图1可知，在其他因素相同条件下，随着香葱提取液用量逐渐增加，在香葱用量1～3 mL范围内，亚硝酸盐清除率呈逐渐上升趋势，并在香葱提取液用量3 mL时亚硝酸盐清除率达到最大，达88.23%。但随着香葱提取液用量继续增加，亚硝酸盐清除率反而降低，可能是由于用量越大，其中掺杂的无关物质也相对增多，使得有效物质浓度相对降低，对清除亚硝酸盐有一定的消极影响。

图1 不同香葱提取液用量对亚硝酸盐清除率的影响

2.1.2 水浴温度对香葱提取液清除亚硝酸盐的影响

香葱提取液是利用水浴法制备的。由图2可知，在55～85 ℃的温度范围内，由于水浴温度的升高，香葱提取液对亚硝酸盐的清除能力逐渐增强，试验中，85 ℃时对亚硝酸盐清除达到最大值，但在95 ℃温度下亚硝酸盐清除率开始略有下降。

图2 不同水浴温度对亚硝酸盐清除率的影响

2.1.3 pH对香葱提取液清除亚硝酸盐的影响

由图3可知，pH在9～12的范围内，亚硝酸盐清除率逐渐增加，pH达12时，亚硝酸盐清除率达到最大值74.88%，随后略有下降。出现该种现象的原因可能是：利用盐酸萘乙二胺法来测定亚硝酸盐时，必须是在碱性条件下进行，但是若碱性过强，则会对反应的稳定性和活性物质的活性产生一系列消极影响，从而使得亚硝酸盐清除率下降。通过与其他四大单因素试验结果的比较发现，不同pH对于亚硝酸盐清除率的影响差别不够大，并且在最佳pH条件对亚硝酸盐清除率只达74.88%，相对于其他因素对于亚硝酸盐清除率的最大值而言该清除率较低，因此，该单因素不作为主要影响因素。

图3 不同pH对亚硝酸盐清除率的影响

2.1.4 水浴时间对香葱提取液清除亚硝酸盐的影响

由图4可知，在30 min中内，亚硝酸盐清除率呈现先升高后降低趋势，并在15 min时清除率达到最大值73.23%，随着水浴时间的增加和水浴温度的升高，香葱提取液中活性物质的结构遭到破坏，从而降低亚硝酸盐清除率。

图4 不同水浴时间对亚硝酸盐清除率的影响

2.1.5 反应时间对香葱提取液清除亚硝酸盐的影响

由图5可知，在5～15 min范围内，亚硝酸盐清除率快速上升，反应时间15 min时，亚硝酸盐清除率达到最大值87.97%，之后反应时间越长亚硝酸盐清除率越低，这可能是由于反应时间过长，反应向着逆反应方向进行，由此导致亚硝酸盐清除率降低。

图5 不同反应时间对亚硝酸盐清除率的影响

2.2 Box-Behnken试验设计与结果分析

2.2.1 Box-Behnken试验设计方案与结果

由单因素试验结果，经Design-Expert 13统计分析软件设计出的试验方案及试验结果见表2，以香葱提取液用量（A）、水浴温度（B）、反应时间（C）为自变量，亚硝酸盐清除率（Y）作为响应值优化香葱提取液清除亚硝酸盐的条件。

表2 Box-Behnken试验设计与结果

2.2.2 Box-Behnken试验回归方程拟合与方差分析

使用Design-Expert 13响应面设计软件，对香葱提取液反应的各种因素和水平进行设计后，对所得数据进行回归分析，回归分析结果如表3所示，并测定所有组的响应值，拟合优化得出二次多项回归方程：Y=86.49+2.59A-0.1150B+2.46C-1.33AB+0.02255AC-0.1625BC-7.31A2-8.39B2-5.39C2。

表3 回归模型及方差分析

回归模型的R2=0.9923，Radj2=0.9825，由方差分析可知，该回归模型的P＜0.001，方程模拟达到极显著，但失拟项P=0.1464＞0.05，不显著，这表明该回归方程拟合度较高，与实际拟合中非正常误差所占比例较小，能够对亚硝酸盐清除率进行可靠预测，也说明该回归方程用于不同条件下香葱提取液对亚硝酸盐清除率影响的响应面优化试验的理论推测可行。

由表3方差分析结果可知，FA=59.04，FB=0.12，FC=53.05，可得FA＞FC＞FB，即影响亚硝酸盐清除率因素的主次顺序为A＞C＞B，即香葱提取液用量＞反应时间＞水浴温度。一次项中A（香葱提取液用量）、C（反应时间）对亚硝酸盐清除率的影响极显著（P＜0.01），但B（水浴温度）对亚硝酸盐清除率的影响不显著。这可能是由于利用水浴法制备香葱提取液时溶出物（有效活性物质）的量是固定的，不会因为温度的变化而有大幅改变，或是说明溶出物（有效活性物质）耐热性较高，不因为温度高而失活。在交互作用中，AB表现为显著（P＜0.05），但AC、BC间的交互作用不显著，二次项A2、B2、C2表现为极显著（P＜0.01），表示香葱提取液用量及水浴温度不同时，亚硝酸盐清除率受到的影响无法由简单的线性关系表示，并且香葱提取液用量和水浴温度的交互作用对亚硝酸盐清除率影响显著。但是对于其他两对交互因素而言，则是主要考虑各自的主效应影响。

2.2.3 响应面图分析

为研究亚硝酸盐清除率中各因素的交互作用，由试验设计所得响应面曲线图和等高线图如图6所示。

图6 各因素对亚硝酸盐清除率的交互作用影响的响应面曲线图和等高线图

由图6（C）可知，亚硝酸盐清除率随着香葱提取液用量的增加，水浴温度的变化使得亚硝酸盐清除率呈现逐渐升高再逐渐降低的趋势，有明显弧度的曲面，说明香葱提取液用量和水浴温度对亚硝酸盐清除率的影响较大；由图6（A和B）可知，在相同反应时间和香葱提取液用量的条件下，亚硝酸盐清除率随着水浴温度的增加变化幅度不算大，两两数据见相差较小，香葱提取液用量对其影响大于反应时间；由图6（B和C）可知，保持香葱提取液用量和水浴温度相同的情况下，随着反应时间的增加，亚硝酸盐清除率先上升再有小幅下降，反应时间对其影响大于水浴温度的影响；等高线图的形状可以反映出不同因素间的交互作用强弱，即圆形表示交互作用不显著，椭圆形表示交互作用显著。由此，图6（C）的等高线图呈椭圆形，可知AB的交互作用显著，但图6（B和A）的等高线图偏向于圆形，说明AC、BC的交互作用不显著，分析结果与方差分析结果一致。

2.2.4 验证试验

采用Design-Expert 13软件对香葱提取液清除亚硝酸盐反应条件试验模型进行分析，得到香葱提取液清除亚硝酸盐的最佳反应条件：水浴温度84.771 ℃，香葱提取液用量3.180 mL，反应时间16.140 min，亚硝酸盐清除率被预测为87.01%。为验证香葱提取液清除亚硝酸盐反应条件响应面优化模型的准确性和方便操作，调整验证参数：水浴温度85 ℃、香葱提取液用量3 mL、反应时间16 min，进行验证试验。在实际试验操作中测得的亚硝酸盐清除率为86.35%，预测值与实际值较为接近，表明回归方程可以反映各因素对香葱提取液清除亚硝酸盐能力的影响，具有实际应用价值。

3 结论

试验证明香葱提取液对于亚硝酸盐有一定的清除能力，通过单因素试验得到最佳反应条件，即反应时间15 min、香葱提取液用量3 mL、水浴温度85 ℃、水浴时间15 min、pH 12。在单因素试验结果中，确定香葱提取液用量、反应时间、水浴温度为主要影响因素，通过三因素三水平响应面法优化得到的反应条件是水浴温度85 ℃、香葱提取液用量3 mL、反应时间16 min。在此条件下，香葱提取液对香肠中亚硝酸盐清除率达到最大。