Rap1 GTP酶激活蛋白对结肠癌细胞增殖、侵袭和迁移作用的影响

靳 英,付小霞,段瑞敏,郝力瑶,李 峰

结肠癌发病率位居全球癌症的第3位,也是癌症相关死亡的第二大原因,2020年全球约190万新发病例,死亡约93.5万例[1]。近年,结肠癌的治疗虽取得较大进展,但晚期诊断和治疗失败,导致结肠癌患者的预后仍较差。因此,寻找新的癌基因对探求结肠癌的病理、生理机制,提供新的肿瘤预警和治疗方法具有重要意义。

Rap1 GAP是Rap1的GTP酶激活蛋白,可使与Rap1结合的GTP水解为GDP,从而促进蛋白失活。Rap1 GAP家族作为肿瘤抑癌基因被逐渐认识。Rap1是Ras家族的成员之一,属于小分子G蛋白,可影响细胞的增殖、黏附和血管生成等生理过程。Rap1存在两种构象,与GDP结合后使其失活,与GTP结合后可发挥其生物学效应。Rap1活性失调与肿瘤的发展密切相关,故调控Rap1活性的Rap1 GAP也参与肿瘤的恶性进展[2-3]。已有研究表明,与良性病变相比,Rap1 GAP在多种恶性肿瘤中表达降低,提示其可能是肿瘤细胞恶性转化中的重要环节[4]。本文旨在探讨Rap1 GAP在结肠癌中的表达及对结肠癌细胞恶性生物学行为的影响,为进一步探究结肠癌的发病机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1临床资料 收集2019年1月～2021年12月山西医科大学附属忻州医院存档的125例结肠癌组织和配对的癌旁正常组织标本(距肿瘤边缘>5 cm)。其中高+中分化109例,低分化16例;TNM分期:Ⅰ+Ⅱ期21例,Ⅲ+Ⅳ期104例;男性66例,女59例,年龄39～85岁,平均(66.4±10.2)岁。所有患者术前均未接受新辅助治疗,行结肠癌根治术或姑息性肿块切除术,术后病理检查均证实为腺癌。

1.1.2细胞系 人正常结肠上皮细胞系HCoEPiC和人结肠癌细胞系LOVO、HCT116、SW480,均购自武汉普诺赛公司。

1.1.3主要试剂 Rap1 GAP(19174-1-AP)抗体购自美国Proteintech Group公司;慢病毒由上海吉凯公司构建。RIPA蛋白裂解液购自北京索莱宝公司;DMEM、Ham’s F-12K、McCoy’s 5A和Leibovitz’s L-15培养基购自武汉普诺赛公司,Matrigel胶购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1免疫组化 标本均经10%中性福尔马林固定,常规石蜡包埋,5 μm厚切片,HE染色,镜下观察。免疫组化染色采用EnVision两步法,病变蜡块连续4 μm厚切白胶片,兔抗人Rap1 GAP单克隆抗体(稀释比1 ∶1 000,SAB公司),二抗和免疫组化试剂盒购自福州迈新公司。具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行,用PBS代替一抗作为阴性对照。Rap1 GAP表达定位于胞质和(或)胞膜,肿瘤细胞胞质和(或)胞膜出现棕黄色或褐色颗粒为阳性。(1)根据细胞着色程度计分:无阳性着色为0分,淡黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分。(2)根据阳性细胞百分比计分:阳性细胞数≤10%为1分,11%～50%为2分,51%～75%为3分,>75%为4分。将上述两项评分结果相加作为最终结果:0～3分为(-);4～5分为(+);6～7分为(),其中(-)为缺失表达。

1.2.2细胞培养 人正常结肠上皮细胞系HCoEPiC用90%高糖DMEM培养基培养,人结肠癌细胞LOVO用Ham’s F-12K培养基培养,HCT116用McCoy’s 5A培养基培养,SW480用Leibovitz’s L-15培养基培养,以上培养基均添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素。

1.2.3Western blot法 细胞于细胞裂解液和蛋白酶抑制剂混合物中裂解30 min,将获得的蛋白上清进行定量后样品使用10%SDS-PAGE凝胶进行电泳分离,然后转移至PVDF膜。PVDF膜经5%脱脂牛奶封闭,加入相应一抗Rap1 GAP(稀释比1 ∶5 000)和β-actin(稀释比1 ∶10 000)孵育。随后与辣根过氧化物标记山羊抗兔二抗(稀释比1 ∶10 000)避光孵育,并通过化学发光仪显影后分析条带。

1.2.4慢病毒转染和分组 sh-Rap1 GAP慢病毒和LV-Rap1 GAP慢病毒及其对照慢病毒(sh-NON和LV-NON)由上海吉凯基因构建。按照吉凯公司提供的慢病毒转染手册进行转染实验,转染72 h后,以5 μg/mL嘌呤霉素筛选转染成功的结肠癌LOVO、HCT116、SW480细胞,作用时长为5～7天。将筛选存活细胞,使用2.5 μg/mL嘌呤霉素继续培养。

1.2.5MTT法检测细胞增殖 将细胞按每孔3×103个的密度接种于96孔板,培养1～3天,采用MTT法检测细胞增殖水平,酶标仪检测波长为490 nm处的吸光度值。

1.2.6Transwell实验检测细胞侵袭和迁移能力 Transwell侵袭实验:上室加入65 μL Matrigel,置于培养箱中放置1.5 h,随后向上室加入200 μL无血清细胞悬液(包含5×104个细胞),下室加入600 μL完全培养基。Transwell迁移实验:按照上述方法将3×105个细胞置于1 mL不含血清的培养基内,吹打混匀,吸取200 μL的无血清细胞悬液接种于Transwell上室内,下室为600 μL完全培养基(含有血清)。24 h后取出24孔板,使用4%多聚甲醛固定细胞30 min,PBS冲洗3～5次,每次15 min,使用1%结晶紫室温染色15 min,用PBS清洗,倒置显微镜下观察上室底面细胞数。

2 结果

2.1 Rap1 GAP缺失表达与结肠癌临床病理特征的关系125例结肠癌标本中,Rap1 GAP缺失表达83例,缺失表达率为66.4%,癌旁对照组织Rap1 GAP缺失表达9例,缺失表达率为7.2%,两组间差异有统计学意义(P<0.001)。结肠癌中,Rap1 GAP缺失表达与肿瘤分化程度(P=0.011)、是否伴黏液腺癌(P=0.028)有关,而与患者性别、年龄、肿瘤发生部位、临床分期和淋巴结转移均无关(表1)。

表1 Rap1 GAP缺失表达与结肠癌临床病理特征的关系[n(%)]

2.2 不同结肠癌细胞系中Rap1 GAP的表达Western blot法检测人正常结肠上皮细胞HCoEPiC和人结肠癌细胞系LOVO、HCT116、SW480中Rap1 GAP的表达,结果显示,与人正常结肠上皮细胞HCoEPiC(0.189±0.081)相比,Rap1 GAP在LOVO(0.238±0.008)细胞中表达最高,在HCT116(0.064±0.002)、SW480(0.152±0.026)细胞中的表达较低,差异有统计学意义(F=159.6,P<0.05,图1)。

图1 Western blot法检测结肠癌细胞系中Rap1 GAP的表达:与HCoEPiC相比,*P<0.05

2.3 下调Rap1 GAP表达对LOVO细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响选取LOVO细胞转染Rap1 GAP低表达慢病毒,Western blot法检测结果显示,LOVO细胞中sh-Rap1 GAP-1组(0.733±0.071)、sh-Rap1 GAP-2组(0.559±0.136)和sh-Rap1 GAP-3组(0.606±0.037)的Rap1 GAP蛋白表达水平比LOVO组(1.880±0.129)明显降低(F=49.57,P<0.05,图2A),sh-NON组Rap1 GAP表达与LOVO组相比,差异无统计学意义(图2A)。选用sh-Rap1 GAP-2、sh-Rap1 GAP-3和sh-NON组进行细胞功能检测。MTT增殖实验结果显示:培养72 h时,与sh-NON组(1.260±0.109)相比,sh-Rap1 GAP-2组(1.569±0.059)和sh-Rap1 GAP-3组(1.548±0.087)细胞增殖能力显著提高(F=28.36,P<0.05,图2B)。Transwell侵袭实验结果显示:sh-Rap1 GAP-2、sh-Rap1 GAP-3组细胞侵袭能力明显高于sh-NON组(P<0.05,图2C)。Transwell迁移实验与侵袭实验结果一致(P<0.05)。

图2 下调Rap1 GAP表达对LOVO细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响:A. Western blot法检测Rap1 GAP蛋白表达水平;B.MTT实验检测下调Rap1 GAP后各组细胞的增殖水平;C.Transwell实验检测各组细胞侵袭和迁移能力;与sh-NON组比较,*P<0.05

2.4 上调Rap1 GAP表达对HCT116和SW480细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响选取HCT116和SW480细胞转染Rap1 GAP过表达慢病毒,Western blot结果显示,HCT116细胞转染过表达慢病毒后,与LV-NON组(0.485±0.097)相比,LV-Rap1 GAP组(1.395±0.137)Rap1 GAP蛋白表达相对较高,差异有统计学意义(P<0.05,图3A)。MTT实验结果显示,培养72 h时,与LV-NON组(0.652±0.047)相比,LV-Rap1 GAP组(1.212±0.038)细胞增殖能力显著降低(P<0.05,图3B);Transwell实验结果显示,与LV-NON组相比,LV-Rap1 GAP组细胞侵袭和迁移能力显著降低(P<0.05,图3C)。

图3 上调Rap1 GAP表达对HCT116、SW480细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响:A.Western blot法检测Rap1 GAP蛋白表达水平,与LV-NON组相比,*P<0.05;B.MTT实验检测上调Rap1 GAP后各组细胞的增殖水平,与LV-NON组相比,*P<0.05;C.Transwell实验检测各组细胞的侵袭和迁移能力

SW480细胞的转染结果,增殖、侵袭和迁移能力与HCT116细胞一致。

3 讨论

Rap1属于GTP酶蛋白,可通过与其他蛋白相互作用,调节肿瘤细胞的迁移、侵袭、转移等病理、生理过程,Rap1信号通路的激活与恶性肿瘤的侵袭性表型相关,活化形式的Rap1受到GTP酶激活蛋白的负调控[5]。Rap1 GAP是针对Rap1具有GTP酶活性的蛋白,研究发现Rap1 GAP在卵巢癌[6]、子宫颈癌[7]、乳腺癌[8]、胃癌[9]、子宫内膜癌[10]等多种肿瘤中缺失表达,且Rap1 GAP缺失表达与胃癌、子宫内膜癌等肿瘤的不良预后有关,提示其可能作为肿瘤抑制因子发挥作用。本组采用人结肠癌细胞系检测Rap1 GAP表达,与人正常结肠上皮细胞系HCoEPiC相比,Rap1 GAP在人结肠癌细胞系HCT116和SW480中的表达被抑制,而在LOVO细胞中Rap1 GAP表达较高,其表达水平与人正常结肠上皮细胞HCoEPiC相近。Rap1 GAP在结肠癌细胞系中的表达变异可能与结肠癌不同亚型的分子异质性和临床病理特征有关,表明即使是同一癌种,不同来源的肿瘤细胞系Rap1 GAP的表达情况也不尽相同;提示肿瘤的发生、发展是多因素、多信号通路调控的复杂过程,Rap1 GAP在肿瘤发展中的作用有待进一步分析。

恶性肿瘤发展过程中最关键的步骤是肿瘤细胞获得迁移和转移能力。Xu等[11]发现,miR-3121-3p诱导的甲状腺乳头状癌的细胞迁移和侵袭能力可以被升高的Rap1 GAP消除。同样,在胃癌中Rap1 GAP也是miR-3121-3p的靶基因之一[12]。Dong等[13]通过细胞划痕实验证实Rap1 GAP过表达会损害TPC-1和Hth83细胞以及滤泡性甲状腺癌细胞FTC-133的迁移。胃癌相关体外研究结果显示,过表达Rap1 GAP可促进E-cadherin的表达,抑制MMP-2的表达,抑制胃癌细胞的迁移和侵袭能力[14]。本实验通过构建高表达Rap1 GAP的结肠癌细胞系发现,在培养24、48和72 h后,高表达Rap1 GAP的结肠癌细胞系SW480和HCT116的增殖、迁移和侵袭能力均显著降低。这表明Rap1 GAP在结肠癌细胞系中的稳定表达可抑制癌细胞的活力,提示Rap1 GAP表达是结肠癌细胞增殖能力的决定因素之一。

虽然在多种类型的肿瘤中均观察到Rap1 GAP的缺失表达[15],但本实验结果显示,结肠癌细胞LOVO中Rap1 GAP表达与人正常结肠上皮细胞HCoEPiC相近,为进一步验证Rap1 GAP在人结肠癌细胞中的作用,本实验沉默LOVO细胞中Rap1 GAP的表达,发现抑制Rap1 GAP表达后,LOVO细胞的增殖能力在短期内(48 h)与对照组相比差异无统计学意义,72 h后其增殖能力显著增加,提示抑制Rap1 GAP表达促进结肠癌细胞的增殖。在上皮性肿瘤中,细胞与细胞接触减弱和细胞与基质黏附性改变是肿瘤扩散的重要促成因素,细胞与细胞黏附的丧失使肿瘤细胞从原发肿瘤部位分离,细胞与基质黏附的改变为肿瘤细胞侵袭周围基质提供机会,最终导致肿瘤侵袭[16]。Tsygankova等[17]观察到Rap1 GAP表达缺失细胞表现出显著的细胞形态变化,细胞与细胞间更加分散,减弱了细胞间的黏附,且沉默Rap1 GAP可增强肿瘤细胞对胶原蛋白的黏附,而胶原蛋白是肿瘤基质的重要成分,这些可促进肿瘤细胞的增殖和迁移。在甲状腺乳头状癌的研究中同样观察到,敲除Rap1 GAP可促进甲状腺乳头状癌细胞的迁移和侵袭[18]。本组Transwell实验发现Rap1 GAP缺失表达的LOVO细胞具有较强的侵袭及迁移能力。Shah等[19]在乳腺癌的研究中亦发现,Rap1 GAP在乳腺导管原位癌中高表达,在浸润性导管癌中表达下调,Rap1 GAP表达降低导致细胞黏附性降低、细胞骨架重塑。上述研究结果提示Rap1 GAP在不同肿瘤中的具体作用或存在差异,需进一步分析。本组人结肠癌组织中Rap1 GAP缺失表达率明显高于癌旁正常组织,低分化结肠癌中Rap1 GAP缺失表达率高于高+中分化者,提示Rap1 GAP表达状态与结肠癌分化程度相关。Gao等[20]报道,结直肠癌中Rap1 GAP表达降低与侵袭深度、淋巴结转移和分期晚等预后不良因素显著相关,与本实验结果相似。另外,本实验还发现伴黏液腺癌者Rap1 GAP缺失表达率高于不伴黏液腺癌者,表明Rap1 GAP表达状态与结肠癌组织学分型相关。

综上,Rap1 GAP表达是肿瘤细胞增殖活性的决定因素,上调Rap1 GAP表达可抑制结肠癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力等恶性生物学行为,沉默Rap1 GAP能促进结肠癌细胞的迁移。Rap1 GAP缺失表达与结肠癌分化程度及伴有黏液腺癌有相关性,提示Rap1 GAP可能作为肿瘤抑制因子在调控恶性肿瘤的进展中发挥重要作用。