协日嘎-4 味散成分组成分析及6 种成分含量测定

李 君，王跃武，张 谦，翠 平，叶日贵，吉日木巴图*

（1.内蒙古医科大学药学院，内蒙古 呼和浩特 010110； 2.内蒙古医科大学新药筛选工程研究中心，内蒙古 呼和浩特 010110； 3.内蒙古医科大学民族医药创新中心，内蒙古 呼和浩特 010110）

协日嘎-4 味散收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》 （蒙药分册），由姜黄、蒺藜、黄柏、栀子4 味中药组成，具有杀黏、清热、利尿之功，临床用于治疗小便闭止、尿频尿急、尿中带血、膀胱刺痛等［1］，而且对糖尿病诱发的肾病综合征、皮肤溃疡也有较好疗效［2-3］。近年来，有关协日嘎-4 味散的研究大多集中于药效评价、作用机制等方面，鲜有涉及化学组成、质量控制。

传统中药复方所含化学成分是其发挥功效的基础，对其全面解析有利于药效物质阐明，同时其含量高低与疗效好坏紧密关联，故对其开展快速、精准的多成分含量测定具有较好的现实意义。以往已有学者以单一成分或某味药材中几种成分为指标，对协日嘎-4 味散进行质量评价［4-6］，但尚无基于液质联用技术的多味药材中多成分定量分析的报道。因此，本实验采用高效液相色谱-四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱（HPLC-Q-Exactive-MS） 法分析协日嘎-4 味散成分组成，并在此基础上采用高效液相色谱-三重四级杆质谱（HPLC-MS/MS） 法同时测定黄柏碱、绿原酸、栀子苷、小檗碱、芦丁、姜黄素的含量，以期为该方质量评价体系建立及药效物质阐明提供数据支撑。

1 材料

1.1 仪器 AP135W 型电子天平（十万分之一，日本岛津公司）； HPLC-Q-Exactive 型高效液相色谱-质谱联用系统仪［赛默飞世尔科技（中国） 有限公司］； BSA224S 型电子天平［万分之一，赛多利斯科学仪器（北京） 有限公司］； LC-MS 8045型三重四极杆液质联用仪（日本岛津公司）； DS-7510DTH 型数控超声波清洗器（上海生析超声仪器有限公司）。

1.2 试剂与药物 阿魏酸（批号PS012244，纯度≥99.0%）、芹菜素 （批号PS011063，纯度≥98.0%）、木犀草素 （批号PS010346，纯度≥99.0%） 对照品均购自成都普思生物科技有限公司； 枸橼酸 （ 批号 100396-202104，纯度≥99.7%）、栀子苷 （批号110749-201919，纯度≥99.0%）、原儿茶酸（批号110809-202207，纯度≥99.0%）、绿原酸 （批号110753-202119，纯度≥98.5%）、槲皮素 （批号100081-201610，纯度≥99.1%）、芦丁 （批号100080-202012，纯度≥98.5%） 对照品均购自中国食品药品检定研究院；黄柏碱（批号DSTDY002031，纯度98.0%）、小檗碱（批号DSTDY002801，纯度≥98.0%）、异鼠李素（批号DSTDY006301，纯度≥98.0%） 对照品均购自成都德思特生物技术有限公司。

姜黄 （ 批号 20111404 ）、黄柏 （ 批号20111803）、栀子（批号21072703）、蒺藜（批号20110802） 饮片均购自安国市久旺药业有限公司，经内蒙古医科大学药学院渠弼教授鉴定为正品。协日嘎-4 味散 （自制，批号20230218、20230304、20230308、20230310、20230311）。

甲醇、乙腈均为色谱纯； 甲酸、乙酸铵均为分析纯； 水为蒸馏水［屈臣氏集团（香港） 有限公司］。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 定性分析对照品溶液 分别精密称取对照品黄柏碱5.50 mg、绿原酸5.03 mg、栀子苷2.47 mg、小檗碱4.30 mg、芦丁4.01 mg、姜黄素6.26 mg、阿魏酸2.66 mg、木犀草素3.18 mg、槲皮素4.07 mg、原儿茶酸3.89 mg、芹菜素3.85 mg、异鼠李素4.11 mg，置于10 mL 量瓶中，加甲醇超声定容，制成质量浓度分别为550.00、503.00、247.00、430.00、401.00、626.00、266.00、318.00、407.00、389.00、385.00、411.00 μg/mL的贮备液，分别精密量取100 μL，置于同一10 mL量瓶中，即得 （各成分质量浓度分别为5.50、5.03、2.47、4.30、4.01、6.26、2.66、3.18、4.07、3.89、3.85、4.11 μg/mL），在 4 ℃下保存。

2.1.2 定量分析对照品溶液 精密称取对照品栀子苷2.47 mg、姜黄素2.28 mg，置于同一10 mL量瓶中，精密量取“2.1.1” 项下黄柏碱、绿原酸、小檗碱、芦丁贮备液适量，置于同一10 mL 量瓶中，甲醇溶解定容，即得 （黄柏碱、绿原酸、栀子苷、小檗碱、芦丁、姜黄素质量浓度分别为22.00、65.59、247.00、150.50、2.81、228.00 μg/mL），在4 ℃下保存。

2.1.3 供试品溶液 取本品（批号20230218） 约0.5 g，精密称定，置于50 mL 锥形瓶中，加10 mL甲醇，称定质量，封口，超声（功率200 W，频率60 kHz） 提取30 min，冷却至室温，甲醇补足减失的质量，摇匀，0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得定性分析供试品溶液； 精密量取提取液10 μL，甲醇定容至1 mL，精密量取300 μL，甲醇定容至1 mL，0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得定量分析供试品溶液。

2.1.4 空白、阴性样品溶液 不加入本品，按“2.1.3” 项下方法制备空白溶液。分别取缺栀子、缺黄柏、缺姜黄、缺蒺藜的阴性样品适量，按“2.1.3” 项下方法制备阴性样品溶液。

2.2 HPLC-Q-Exactive-MS 定性分析

2.2.1 色谱条件 Agilent ZORBAX SB-Aq 色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）； 流动相甲醇（A） -0.1%甲酸（B），梯度洗脱（0 ～5.0 min，5% A；5.0～8.0 min，5% ～23%A； 8.0～12.0 min，23% ～42%A； 12.0～18.0 min，42% ～58%A； 18.0～23.0 min，58% ～83%A； 23.0～30.0 min，83% ～95%A；30.0 ～40 min，95% A）； 体积流量0.35 mL/min；柱温35 ℃； 进样量5 μL。

2.2.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI）； 正负离子模式扫描； 检测方式Full MS/dd-MS2，Full MS分辨率70 000，dd-MS2分辨率17 500； 扫描范围m/z110～1 200； 喷雾电压3.80 kV （＋）、3.20 kV（-）； 碰撞能量30 eV； 离子传输管温度300 ℃（＋）、400 ℃ （-）； 辅助气体积流量30 L/min，温度350 ℃。

2.2.3 数据库建立 采用PubMed、中国知网、万方等数据库对全方及各味药材所含成分的名称、分子式、多级质谱碎片进行收集整理，Thermo Scientific Xcalibur 3.0 软件对对照品、供试品溶液在正负离子模式下的总离子流数据进行处理，与本地数据库比对，以一级质谱偏差在8.0×10-6以内为原则，初步对各成分进行辨识分析，再通过元素组成、多级质谱碎片信息、部分对照品比对作进一步确认。

2.2.4 成分鉴定 取“2.1.3” 项下定性分析供试品溶液适量，在“2.2.1” “2.2.2” 项条件下进样测定，总离子流图见图1，结果见表1。由此可知，共鉴定出65 种成分，包括19 种生物碱、13种有机酸、13 种黄酮、7 种姜黄素、6 种环烯醚萜、4 种脂肪酸、2 种醛、1 种氨基酸，其中12 种与对照品比对得到进一步确证。

表1 协日嘎-4 味散中化学成分Tab.1 Chemical constituents in Xieriga-4 Powder

图1 协日嘎-4 味散总离子流图Fig.1 Total ion current chromatograms of Xieriga-4 Powder

2.2.5 黄酮类化合物解析 共有13 个，以化合物16 为例。准分子离子峰［M-H］-m/z289.071 6，可产生碎片离子m/z271.059 7 ［M-H-H2O］-、245.081 5 ［M-H-CO2］-，以及逆狄尔斯-阿德尔反应（RDA） 反应产生的m/z151.038 9 ［M-HC7H6O3］-、137.023 2 ［M-H-C8H8O3］-，基于上述裂解规律结合文献［15］ 报道，确认为儿茶素。

2.2.6 环烯醚萜类化合物解析 共有6 个，以化合物14 为例。准分子离子峰 ［M ＋Na］＋m/z415.124 2，脱去葡萄糖基团后产生碎片离子m/z253.069 9 ［M＋Na-Glc］＋，进一步丢失H2O 和CO2，产生碎片离子m/z235.059 4 ［M＋Na-Glc-H2O］＋、217.049 1 ［M＋Na-Glc-2H2O］＋、191.069 7 ［M＋Na-Glc-H2O-CO2］＋，基于上述裂解规律结合文献［11-13］ 报道，确认为山栀子苷。

2.2.7 有机酸类化合物解析 共有13 个，以化合物28 为例。准分子离子峰［M-H］-m/z173.044 5，连续脱去H2O、CO2、CO，产生碎片离子m/z155.033 5 ［M-H-H2O］-、137.023 5 ［M-H-2H2O］-、111.043 8 ［M-H-H2O-CO2］-、93.033 1［M-H-2H2O-CO2］-，基于上述裂解规律结合文献［14］ 报道，确认为莽草酸。

2.2.8 生物碱类化合物解析 共有19 个，以化合物23 为例。准分子离子峰［M］＋m/z342.172 4，可产生碎片离子m/z192.103 5 ［M-C9H10O2］＋，以及发生RDA 反应产生碎片离子m/z192.103 5、177.079 8 ［M-C9H10O2-CH3］＋，基于上述裂解规律、文献［16-17］ 报道及对照品，确认为黄柏碱。

2.2.9 姜黄素类化合物解析 共有7 个，以化合物59 为例。准分子离子峰［M＋H］＋m/z369.135 9，可产生碎片离子m/z285.114 3 ［M＋H-C4H4O2］＋、217.087 1 ［M ＋H-C9H12O2］＋、177.056 1 ［M ＋HC4H4O2-C6H5O2］＋、117.034 3 ［M ＋H-C4H4O2-C6H5O2-C2O2］＋，基于上述裂解规律、文献［19-20］ 报道及对照品，确认为姜黄素。

2.3 HPLC-MS/MS 定量分析

2.3.1 色谱条件 Shim-pack GIST-HP C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，3 μm）； 流动相甲醇（A） -0.1%甲酸（B），梯度洗脱（0.01～0.35 min，5% ～18%A； 0.35～3.10 min，18% ～40%A； 3.10～4.20 min，40% ～66%A； 4.20～5.30 min，66% ～90%A；5.30～7.00 min，90% ～95% A； 7.00 ～8.00 min，95%A； 8.00～8.01 min，95% ～5%A； 8.01～10.00 min，5%A）； 体积流量0.25 mL/min； 柱温35 ℃；进样量3 μL。

2.3.2 质谱条件 ESI 离子源； 正负离子扫描；多反应监测（MRM） 模式； 脱溶剂温度526 ℃；雾化气体积流量3 L/min； 加热气体积流量10 L/min。

2.3.3 专属性试验 MRM 定量模式下各成分质谱参数见表2。取对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在“2.3.1” “2.3.2” 项条件下进样测定，结果见图2，可知阴性无干扰，供试品溶液中各成分保留时间与对照品溶液中的一致。

表2 各成分质谱参数Tab.2 Mass spectrometry parameters for various constituents

图2 各成分MRM 色谱图Fig.2 MRM chromatograms of various constituents

2.3.4 线性关系考察 精密量取“2.1.1” 项下贮备液适量，置于同一10 mL 量瓶中，甲醇稀释定容，得质量浓度分别为0.550、2.515、7.410、1.720、0.802、6.260 μg/mL 的对照品溶液，精密吸取适量，依次稀释100、50、20、10、2.5、2倍，在“2.3.1” “2.3.2” 项条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，结果见表3，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表3 各成分线性关系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.3.5 精密度试验 取“2.3.4” 项下对照品溶液（黄柏碱、绿原酸、栀子苷、小檗碱、芦丁、姜黄素质量浓度分别为 55.00、251.50、741.00、172.00、80.20、626.00 ng/mL ） 适 量，在“2.3.1” “2.3.2” 项条件下进样测定6 次，测得黄柏碱峰面积RSD 为1.14%，绿原酸峰面积RSD为1.46%，栀子苷峰面积RSD 为2.50%，小檗碱峰面积 RSD 为1.65%，芦丁峰面积 RSD 为2.72%，姜黄素峰面积RSD 为2.34%，表明仪器精密度良好。

2.3.6 稳定性试验 取本品（批号20230218） 约0.5 g，精密称定，按“2.1.3” 项下方法制备定量分析供试品溶液，室温下于0、4、8、12、18、24 h在“2.3.1” “2.3.2” 项条件下进样测定，测得黄柏碱峰面积RSD 为1.09%，绿原酸峰面积RSD 为2.68%，栀子苷峰面积RSD 为2.60%，小檗碱峰面积RSD 为1.14%，芦丁峰面积RSD 为2.70%，姜黄素峰面积RSD 为2.33%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.7 重复性试验 取本品（批号20230218） 约0.5 g，精密称定，平行6 份，按“2.1.3” 项下方法制备定量分析供试品溶液，在 “2.3.1”“2.3.2” 项条件下进样测定，测得黄柏碱含量RSD 为1.68%，绿原酸含量RSD 为2.04%，栀子苷含量 RSD 为2.73%，小檗碱含量 RSD 为1.07%，芦丁含量RSD 为2.69%，姜黄素含量RSD 为2.46%，表明该方法重复性良好。

2.3.8 加样回收率试验 取各成分含量已知的本品（批号20230218） 6 份，每份约0.25 g，精密称定，按100% 水平加入“2.1.2” 项下定量分析对照品溶液1 mL，按“2.1.3” 项下方法制备定量分析供试品溶液，在“2.3.1” “2.3.2” 项条件下进样测定，计算回收率。结果，黄柏碱平均加样回收率为97.86% （RSD＝3.09%），绿原酸平均加样回收率为96.44% （RSD＝2.05%），栀子苷平均加样回收率为99.72% （RSD ＝3.12%），小檗碱平均加样回收率为102.37% （RSD ＝3.62%），芦丁平均加样回收率为97.46% （RSD ＝2.56%），姜黄素平均加样回收率为100.17% （RSD＝3.74%）。

2.3.9 样品含量测定 取5 批样品，每批3 份，按“2.1.3” 项下方法制备定量分析供试品溶液，在“2.3.1” “2.3.2” 项条件下进样测定，计算含量，结果见表4。

表4 各成分含量测定结果（n＝3）Tab.4 Results for content determination of various constituents （n＝3）

3 讨论

考虑到协日嘎-4 味散所含成分可能在不同流动相体系中的质谱响应强度有所差异，课题组前期对不同流动相体系进行考察，发现以甲醇-0.1%甲酸洗脱时各成分质谱响应强度、色谱峰数量较优。另外，协日嘎-4 味散富含生物碱类成分，因其所含N 原子的电负性优于C 原子而易捕获1 个质子［17］，使得该类成分在正离子模式下具有较好的质谱响应，同时大部分黄酮类、有机酸类成分更易失去1 个质子，从而在负离子模式下的质谱响应较好，故本实验采用正负离子模式进行分析。

然后，对6 种成分进行离子化模式分析，发现绿原酸、芦丁、姜黄素、栀子苷在负离子模式下质谱响应较好，而黄柏碱、小檗碱在正离子模式下响应强度较高，经离子扫描、电压优化获得表2 质谱参数。同时，课题组前期对样品处理方式（超声、加热回流）、处理时间（15、30、45 min） 进行考察，最终确定为超声处理30 min。

4 结论

本实验采用HPLC-Q-Exactive-MS 法在协日嘎-4 味散中鉴定了65 种成分，包括19 种生物碱、13种有机酸、13 种黄酮、7 种姜黄素、6 种环烯醚萜、4 种脂肪酸、2 种醛、1 种氨基酸，再采用HPLC-MS/MS 法测定黄柏碱、绿原酸、栀子苷、小檗碱、芦丁、姜黄素的含量，上述方法快速简便，可为该方药效物质、质量标准研究提供依据，也能为其血清移行成分解析、药动学评价指明方向。