桔梗生药粉湿热灭菌工艺优化及不同灭菌方法对其质量的影响

孙 艳，刘源慧，郭田甜，毕艳艳，金 凤，沈庆国，张娜娜，高艳红∗，关永霞∗

（1.鲁南制药集团股份有限公司经方与现代中药融合创新全国重点实验室，山东 临沂 276006； 2.鲁南厚普制药有限公司，山东 临沂 276006）

桔梗为桔梗科植物桔梗Platycodongrandiflorum（Jacq.） A.Dc.的干燥根，具有宣肺利咽、祛痰排脓功效［1］。桑菊感冒片由桑叶、菊花、连翘、薄荷素油、苦杏仁、桔梗、甘草、芦根组成，具有疏风清热、宣肺止咳作用，在制备过程中桔梗粉碎成细粉直接入药。

按照2020 年版《中国药典》 规定，直接入药的生药粉必须进行灭菌。目前，辐射灭菌、乙醇蒸汽灭菌、湿热灭菌、干热灭菌是常用的中药生药粉灭菌方法［2-7］，但均存在不同程度的缺陷，故灭菌时要结合药材本身性质、有效成分特点、实际生产情况等方面来选择最有效的方法［2，8］。其中，湿热灭菌能力强，简便易行，成本低，适用于大生产［9］，由于桔梗中有效成分对热不敏感，不易水解，故本实验采用该灭菌方法，并通过响应面法进行优化，再考察不同灭菌方法对该药材质量的影响，以期为其后续开发及工业化生产提供依据。

1 材料

UltiMate 3000 型高效液相色谱仪，配置Alltech ELSD 6000 型蒸发光散射检测器（美国Thermo 公司）； 电热鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）； ZK-82B 型真空干燥箱（上海实验仪器厂有限公司）； XS204 型电子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）； 脉动真空灭菌柜（山东新华医疗器械股份有限公司）。

桔梗皂苷D 对照品（批号220317，质量浓度0.341 9 mg/mL） 购自中国食品药品检定研究院。桔梗（批号210910） 购自安国市宇通药材有限公司，经鲁南制药集团股份有限公司范建伟高级工程师鉴定为桔梗科植物桔梗Platycodongrandiflorum（Jacq.） A.Dc.的干燥根。色谱纯甲醇 （批号I1176407147）、乙腈（批号K54086430211） 均购自德国默克公司； 分析纯甲醇（批号220616035F）购自南京化学试剂有限公司； 水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 生药粉灭菌

2.1.1 生药粉制备 取桔梗适量，粉碎后过6 号筛，即得。

2.1.2 湿热灭菌样品制备 按照2020 年版《中国药典》 四部1421 通则项下方法，取200 g 生药粉，置于脉动真空灭菌柜中，在103 ℃下灭菌30 min，再放入真空干燥箱中干燥，取出，即得。

2.1.3 辐照灭菌样品制备 按照2020 年版《中国药典》 四部1421 通则项下方法，取200 g 生药粉，置于灭菌室中，60Co 射线以6 kGy 剂量辐照，取出，即得。

2.1.4 干热灭菌样品制备 按照2020 年版《中国药典》 四部1421 通则项下方法，取200 g 生药粉，在160～170 ℃下灭菌20 min，再放入真空干燥箱中干燥，取出，即得。

2.1.5 乙醇灭菌样品制备 取200 g 生药粉，75%乙醇浸润后密闭灭菌2 h，放入恒温干燥箱中24 h，取出，再放入真空干燥箱中干燥，取出，即得。

2.2 桔梗总皂苷含量测定 参照2005 年版《中国药典》 （新版药典已不再收录该项目）［10］一部桔梗［含量测定］ 项下方法测定。

2.3 桔梗皂苷D 含量测定 参照2020 年版《中国药典》 一部桔梗［含量测定］ 项下方法测定。

2.3.1 色谱条件 YMC-Pack ODS-A 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流动相乙腈-水（25 ∶75）；体积流量1.0 mL/min； 柱温30 ℃； 进样量10 μL。

2.3.2 对照品溶液制备 精密称取桔梗皂苷D 对照品适量，甲醇制成质量浓度为0.5 mg/mL 溶液，即得。

2.3.3 供试品溶液制备 参照2020 年版《中国药典》 一部桔梗［含量测定］ 项下方法制备，即得。

2.3.4 线性关系考察 分别取“2.3.2” 项下对照品溶液1、2、5、10、15、20 μL，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定。以峰面积对数（Y） 对进样量对数（X） 进行回归，得方程为Y＝0.544 8X－0.463 2 （r＝0.999 8），在0.496 8 ～7.452 0 μg 范围内线性关系良好。

2.4 灭菌率测定 根据2020 年版《中国药典》四部1105 通则项下的非无菌产品微生物限度检测法，采用平板计数法测定灭菌率，公式为灭菌率＝［（未处理样品菌总数－处理样品菌总数） /未处理样菌总数］ ×100% （样品菌总数＝样品细菌总数＋霉菌及酵母菌总数）。

2.5 权重系数确定 根据灭菌目的和桔梗主要药效成分功效，选择桔梗皂苷D 含量、桔梗总皂苷含量、灭菌率作为指标，采用AHP 法确定三者权重，首先将其分为3 个层次［11］，再确定优先顺序为桔梗皂苷D 含量＞桔梗总皂苷含量＞灭菌率［11］，最后构建优先判断矩阵，见表1。结果，桔梗皂苷D 含量、桔梗总皂苷含量、灭菌率权重系数分别为0.633 3、0.260 5、0.106 2，CR ＝0.037 2＜0.1，表明优先判断矩阵一致性良好，权重系数有效［12-13］。

表1 各指标优先判断矩阵Tab.1 Priority judgment matrices for various indices

2.6 单因素试验 初步确定各指标水平分别为灭菌时间10、15、30、45、60、75 min，灭菌温度95、100、105、110、115、120 ℃，干燥温度50、60、70、80、90、100 ℃，单因素试验时固定其余参数（灭菌时间30 min，灭菌温度100 ℃，干燥温度80 ℃） 不变，结果见图1～3。

图1 灭菌时间对综合评分的影响Fig.1 Effect of sterilization time on comprehensive score

图1 显示，随着灭菌时间延长，综合评分先升后降，为30 min 时最大，故选择15、30、45 min。图2 显示，随着灭菌温度增加，综合评分先升后降，为105 ℃时最高，故选择100、105、110 ℃。图3 显示，干燥温度低于90 ℃时综合评分变化不大，但大于90 ℃时显著降低，故选择70、80、90 ℃。

图2 灭菌温度对综合评分的影响Fig.2 Effect of sterilization temperature on comprehensive score

图3 干燥温度对综合评分的影响Fig.3 Effect of drying temperature on comprehensive score

2.7 响应面法 在单因素试验基础上，选择灭菌时间（A）、灭菌温度（B）、干燥温度（C） 作为影响因素，桔梗皂苷D、桔梗总皂苷含量及灭菌率的综合评分 （Y） 作为评价指标，采用Design-Expert 8.0.6.1 软件进行优化，因素水平见表2，结果见表3。

表2 响应面法因素水平Tab.2 Factors and levels for response surface method

表3 响应面法设计与结果Tab.3 Design and results for response surface method

采用Design-Expert 8.0.6.1 软件对表3 数据进行二次多元回归分析，得方程为Y＝94.45＋4.39A－4.71B－1.58C－2.21AB－4.02AC－1.07BC－8.73A2－9.69B2－3.99C2，其R2（0.990 3）、均接近1，并且两者之间也接近，表明模型拟合度良好，方差分析见表4。由此可知，模型P＜0.01，具有高度显著性； 失拟项P＞0.05，表明模型稳定，可用于预测分析； CV 为1.60%，表明实验误差小，操作可信度高； 因素A、B、C、AB、AC、A2、B2、C2有显著或极显著影响（P＜0.05，P＜0.01）；各因素影响程度依次为B＞A＞C。

表4 方差分析结果Tab.4 Results for analysis of variance

采用Design-Expert 8.0.6.1 软件进行响应面分析，结果见图4～6。由图4 可知，当灭菌时间一定时随着灭菌温度增加，综合评分逐渐升高，超过103 ℃时开始降低； 当灭菌温度一定时随着灭菌时间延长，综合评分逐渐升高； 当灭菌时间超过35 min 时，综合评分开始降低。由图5 可知，当干燥温度一定时随着灭菌时间延长，综合评分逐渐升高，但超过35 min 时开始降低； 当灭菌时间一定时随着干燥温度增加，综合评分逐渐升高，但超过76 ℃时程度趋缓。由图6 可知，当干燥温度一定时随着灭菌温度增加，综合评分逐渐升高，但超过103.7 ℃时开始降低； 当灭菌温度一定时随着干燥温度增加，综合评分缓慢升高，但超过76 ℃时开始降低； 因素B曲面较陡峭，提示它对响应值有显著影响，其次是A、C。

图5 干燥温度、灭菌时间响应面图Fig.5 Response surface plots for drying temperature and sterilization time

图6 干燥温度、灭菌温度响应面图Fig.6 Response surface plots for drying temperature and sterilization temperature

最终确定，最优工艺为灭菌时间35.47 min，灭菌温度103.67 ℃，干燥温度76.55 ℃，结合实际生产及可操作性，将其修正为灭菌时间35 min，灭菌温度103 ℃，干燥温度76 ℃，按上述优化工艺进行3 批验证试验，结果见表5。由此可知，该工艺稳定可行（RSD＜3%），重复性好，可用于湿热灭菌工艺。

表5 验证试验结果（n＝3）Tab.5 Results for verification tests （n＝3）

2.8 不同灭菌方法对桔梗生药粉质量的影响

2.8.1 微生物限度 按照2020 年版《中国药典》四部通则1108 中药饮片微生物限度检查法进行检测，结果见表6，可知各检查项均合格。

表6 微生物限度检查结果Tab.6 Results for microbial limit tests

2.8.2 质量检查 按照2020 年版《中国药典》一部桔梗项下要求，对灭菌前后鉴别项、水分、总灰分、酸不溶灰分、浸出物、含量测定进行检测，结果见表7，可知各检查项均合格。

表7 质量检查结果Tab.7 Results for quality tests

2.8.3 指纹图谱建立 分别精密称取经湿热灭菌、辐照灭菌、乙醇灭菌、干热灭菌处理后样品及未灭菌样品适量，加入25 mL 50%甲醇，称定质量，超声处理30 min，放冷，50%甲醇补足减失的质量，过滤，取续滤液。分析条件为YMC-Pack ODS-A 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流动相0.1%磷酸（A） -乙腈 （B），梯度洗脱 （0 ～20 min，10% ～14% B； 20 ～35 min，14% ～20% B； 35 ～55 min，20% ～30% B； 55 ～60 min，30% B； 60 ～70 min，30% ～35%B； 70～80 min，35% ～90%B）； 体积流量0.8 mL/min； 柱温35 ℃； 检测波长210 nm； 进样量10 μL，结果见图7，相似度见表8。由此可知，与未灭菌相比，不同灭菌方法相似度依次为辐照灭菌＞乙醇灭菌＞湿热灭菌＞干热灭菌。

图7 不同灭菌方法所得样品指纹图谱Fig.7 Fingerprints for samples obtained by different sterilization methods

表8 不同灭菌方法所得样品相似度Tab.8 Similarities of samples obtained by different sterilization methods

3 讨论与结论

目前，中药生药粉入药时存在的最大问题是微生物超标［14］、主要药效成分含量变化。本实验比较了乙醇灭菌、湿热灭菌、辐照灭菌、干热灭菌对桔梗生药粉质量的影响，发现不同方法下微生物限度检查均合格； 灭菌后桔梗皂苷D 含量有不同程度的降低，依次为辐照灭菌＞湿热灭菌＞乙醇灭菌＞干热灭菌； 指纹图谱相似度依次为辐照灭菌＞乙醇灭菌＞湿热灭菌＞干热灭菌，推测高温可能导致桔梗皂苷D 含量降低。另外，虽然乙醇灭菌、辐照灭菌对桔梗有效成分的影响均较小，但前者存在较大的安全隐患，后者存在辐照剂量超标的问题； 湿热灭菌法能在短时间内杀灭微生物，灭菌效果可靠，并且对桔梗有效成分影响较小，操作方便安全，生产成本低，可用于大生产中［15-17］。

综上所述，本实验采用响应面法优化桔梗生药粉湿热灭菌工艺，得到最优工艺为灭菌时间35 min，灭菌温度103 ℃，干燥温度76 ℃，验证试验［18］表明其稳定可靠，操作简便，在生产过程中具有可行性。