实验小鼠肝炎病毒研究进展及其检测与防治措施

陈姝彤，王馨，张若文

（北华大学基础医学院 吉林吉林 132000）

1 MHV 的研究进展

1.1 MHV 的病毒特性

在分类上小鼠肝炎病毒（MHV）属冠状病毒科中的冠状病毒属。根据MHV 特性的不同，可将MHV 分为两类：肠毒株和呼吸毒株。肠毒株有MHV-Y、MHV-S、MHV-U 等分型，呼吸毒株又有MHV-1、MHV-2、MHV-A59 等分型[1]，所以感染MHV 后小鼠会有肠炎和肝炎的临床表现。传染源头一般是带毒小鼠的粪便和垫料，MHV 可通过胎盘垂直传播，这导致不带母源抗体的乳鼠感染易发病和死亡[2]。

MHV 是单股正链RNA，且为线性不分段。它的病毒粒子呈多形态或圆形，它的直径一般为80～160 nm[3]。MHC 的核蛋白主要由3 个蛋白结构组成：M 蛋白、S 蛋白和E 蛋白。M 蛋白是其中比较保守的抗原决定蛋白；而S 蛋白主要功能是介导病毒进入宿主细胞，可以识别细胞表面的MHV 病毒受体，近而参与MHV 感染的过程；E 蛋白则是在病毒组装和脱壳过程中发挥催化活性的关键性蛋白。而核蛋白又与RNA 结合之后构成了位于病毒中心的核蛋白壳，其结构呈螺旋状，最后病毒包膜包绕在其上，从而形成病毒粒子[4-5]。

1.2 MHV 的研究进展

通常情况下，pH 值是不会影响病毒蛋白介导的膜融合过程的。但是早期有研究表明，碱性的小肠内MHV 的感染会引起肠上皮细胞融合[6]。所以，MHV 诱导融合的最佳pH 值或许是中性或者碱性。这表明pH 值对MHV 存在着一定的影响，而膜融合蛋白对pH 值依赖的构象变化或许对病毒诱导的细胞膜融合也发挥着相应作用。但是，pH 值对受体依赖的MHV 感染小鼠细胞有着怎样的作用在研究领域还存在一定的争议，这也引起了学者的探讨。目前有研究表明，不依赖pH 值改变，MHV-A59 也可以进入细胞，但是有研究者发现应用溶酶体抑制剂后MHV-A59 的感染程度或许降低。因此，低pH 值有利于MHV-A59 的感染。S 蛋白转染细胞后出现膜融合现象，当pH 值升高，细胞膜融合受构象变化所诱导会逐渐变得更加明显[7-9]。进一步研究表明MHV 的S 蛋白在高pH 值，无受体存在的情况下发生的构象改变和受体依赖的S 蛋白产生的构象改变是很接近的[10]，这也与S 蛋白随着pH 升高发生的构象改变非常接近，所以，pH 值和S 蛋白诱导的膜融合之间的存在的具体关联还需继续研究证明。

2 MHV 的诊断技术

有研究人员发现，给小鼠人工感染MHV 后2 d 内就可以在小鼠肺脏中检测出阳性病毒，随后在其他组织的样本中也可以检测出阳性病毒，病毒阳性率在14 d 后开始降低，所有组织的样本在84 天后的病毒检测结果都是阴性[11]。而抗体则不同，在此小鼠体内的抗体产生周期短，存留时间相对很长，IgG 在5～7 d 内明显升高，标本检测阳性率明显上升，3 周就达到高峰，并且抗体检测阳性可以维持在28 d，之后才开始缓慢下降；而IgM 水平上升的时间更早，3 d 的阳性检测率就开始升高，7 d 则达到高峰，各个标本阳性检测率均良好，3 周之后阳性检测率开始下降[12]。这可以表明，抗原可以作为早期检测而提供帮助，抗体检测具有高稳定性，适用于MHV 的日常监测，同时IgM 也可以考虑用于早期感染的检测指标。

目前，对判断MHV 感染的方法有很多，《实验动物：小鼠肝炎病毒检测方法》中规定的常规检测方法有酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接免疫荧光抗体试验（IFA）和免疫酶试验（IEA）。

2.1 血清学检测方法

由于IEA 存在抗原不易制备的情况，而ELISA 和IFA 均有商品化的常规检测试剂盒，所以，对于常规样本的MHV 检测方法，目前我国的检测机构通常应用ELISA 方法进行初筛试验，而对于阳性的样本再用IFA 方法进行复检[13]。用ELISA 法检测MHV 具有高度的特异性、操作方法简便和用时短等优点。但是不同的MHV 之间的抗原性存在不同，在日常的操作过程中，多采用多价抗原进行检测。有研究实验利用了两种不同的MHV 组合的抗原包被酶标板，从而构建了应用间接ELISA 方法进行的MHV 抗体检测，实验表明这种方法可以检测出更多的阳性标本[14]。但是ELISA 的检测结果需要通过肉眼进行观察颜色来判定，这种方式存在着一定的主观意识，所以ELISA 法经常用于感染的后期，作为回溯性诊断。而相对于ELISA 法而言，IFA 方法的特异性更高，所以经常用作MHV 的确诊实验，但IFA 法的结果判别偏主观，不适合用于大量样本的筛选[15]。

因此，对于实验小鼠的MHV 感染检测，选择合适的ELISA 法检测试剂盒特别重要。所以，检测质量结果的精准与否跟检测用试剂盒的标准化有着很大的关系。选择的检测方法、规范的操作技术和制定的标准化都对研究成果的可信度，精准性和科学性起着决定性的影响。西方欧美等国家已经推出了商业化，规范化，系统化的高品质检测试剂盒，而我国MHV 检测试剂盒的供应方主要集中在3 家左右，并且各个单位的侧重方法不同，可选择性比较小[16]。但进口的ELISA 试剂盒货期较长并且价格昂贵，不足以应对突发情况下的检测需求。广西医科大学选用了均为ELISA 方法的不同种类检测试剂盒，其中两种为国内生产的MHV 抗体试剂盒与外国的一款与之相对应的试剂盒，对这三种试剂盒从特异性、精准性、灵敏性和可靠性四个方面进行了比较，最终筛选出了一款既精准又经济的，适合于学校动物实验的国产MHV 抗体检测试剂盒[17]。所以，我国MHV 检测试剂盒的发展也在稳步前进，检测结果的准确度，精准度，灵敏度同样在稳步提升。

2.2 反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）

除了采用病毒分离培养、ELISA 法、IFA 法等血清学检测方法外，RT-PCR 是用于检测MHV 感染的最常用的方法，RT-PCR 是目前应用效果最好的确证方法之一。目前RT-PCR 的应用仍然存在着一些缺点如：对实验室要求高，检测周期长等，但RT-PCR 检测病毒时所需的样本量少、更是可以在疾病早期检测到病毒感染，所以RT-PCR 检测MHV 也得到了广泛的重视[15]。

有实验研究通过分析MHV 刺突蛋白的基因序列，分别构建了MHV 的两种检测方法：RT-PCR 和Real-time RT-PCR，实验分别使用了小鼠的常见病毒和MHV 同属不同型的冠状病毒作为对照组进行实验，最后确认了所构建方法的特异性，并且实验证实了其所构建的检测方法具有敏感的特异性，也经过了准确性试验的证实，其构建的RT-PCR 方法和Real-time RT-PCR 方法都有很高的精准性和灵敏性。同时这两种方法还具有广泛的适应性，对于尿液、粪便和组织器官这不同的三种样品检测时均能测得良好的结果[18]。此检测方法的研究将对实验动物中MHV 的快速筛查，提高检测效率和阳性检出率奠定良好基础。

3 MHV 的防治措施

通过目前已知的可感染小鼠的微生物和寄生虫毒力的强弱，国际实验动物科学协会（ICLAS）已经将这些微生物和寄生虫分为从A 到E 的5 个等级，MHV 已经确定为B 等级，其毒力是可以导致小鼠死亡的程度。实验小鼠的MHV 感染应引起广大研究学者的高度重视，而对MHV 的防治措施更应该是重中之重。

3.1 定期监测，及早发现

MHV 感染实验小鼠后常常为没有临床症状的隐性或慢性感染表现，在相应的环境下才会引起相应的临床表现，所以要通过定时定点的检测MHV 才能及时发现感染[19]。但是使用实验小鼠的工作人员对实验小鼠的健康程度重视不够，尤其是对于外观健康的小鼠很少进行MHV 的检测。还有实验小鼠的生产方从个人经济效益出发，对实验小鼠的MHV 感染情况监管不全面，不尽力，不严谨，从而造成了小鼠肝炎的传染和漫延，并且我国实验小鼠的传染性疾病检测数据很少，也不能实时，准确地反映国内实验小鼠的MHV 感染状况[20]。所以，在培育实验小鼠，或者用实验小鼠进行研究时，应定期检测MHV 的感染情况，及早发现MHV 的感染才能在源头减少实验小鼠的损失，避免MHV 的感染对实验研究的结果造成不良影响。

3.2 加强实验人员的防控培训，健全动物健康的测评体系

不单单是实验小鼠的健康安全，从管控实验室所用到的所有实验动物健康出发，需要加强实验人员对实验动物健康的防控意识和能力，优化实验人员的实验动物健康培训体系。要健全动物健康监测体系，改变实验小鼠MHV 感染防控的被动局面，建立执行性好并且相对完善的动物健康监测系统是降低实验动物感染MHV 的有效措施。还要探索适合各个实验室的人员防控培训和实验动物健康监测体系，根据不同的地域，不同的实验室，不同的研究方向，实时更新实验动物的健康监测体系。要因地制宜，因“室”制宜，才能完善适合自己实验室的监测体系，这样才能有效地降低实验小鼠感染MHV 的风险，避免实验小鼠因感染MHV 而影响实验进度，还可以提高实验结果的准确性[21]。

3.3 增加对于MHV 感染治疗或者预防的药物研究

目前已有研究表明云南苦茶中主要成分水解型鞣酸单宁（Strictinin）对MHV 感染的小鼠L 细胞有抑制作用。此研究评估了一些茶化合物对小鼠MHV 感染情况的影响，研究表明Strictinin 显著抑制了MHV 的感染，特别是在病毒附着或病毒进入后的时期，Strictinin 可以使MHV 核衣壳蛋白的表达和MHV 子代的产生显著减少[22]。此研究还表明应该通过监测病毒复制步骤以及病毒感染过程中调节的细胞信号传导途径来进一步阐明在Strictinin 治疗后观察到显著抑制作用的潜在机制[23]。对于治疗或者预防MHV 感染的药物研究应该引起研究学者的广泛注意，因为MHV 感染可能代表HCoV-SARS 的感染，MHV 感染的实验小鼠也被认为是SARS 的临床相关模型[24]，所以对此治疗药物的研究不仅能对MHV 感染的实验小鼠有益，还可以延伸到人类感染HCoV-SARS 的治疗，实现研究的延伸。

4 总结与展望

MHV 具有极高的传染性，当感染小鼠的群体免疫功能降低的时候，会使所有小鼠突然发生急性感染，从而导致实验小鼠的大量死亡，最后严重影响实验小鼠的生产和相关动物实验的研究结果[20]。本文对MHV 的研究进展进行综述，并介绍了MHV 的主要检测方法和医学防治措施，旨在有助于实验研究人员了解MHV 的相关研究，并对MHV 的感染引起重视，加强对实验小鼠MHV 感染的防治意识。在防治MHV 感染的方面，不仅是实验研究人员需要注意，生产实验小鼠的实验动物机构也应该引起注意，严格监测MHV 的感染情况，才能有效控制MHV 的传播和漫延。

如今实验动物的安全性问题已经引起研究学者的重视，实验动物安全保证对科研学者的生命健康及实验结果的准确性起着决定性的影响。现在，MHV 的检测技术在不断发展，国内检测MHV的试剂盒也在不断更新，不断完善，对于MHV 的治疗药物更是在研究的道路上不断前行，其防治措施也引起了广大实验研究人员的注意。相信随着对MHV 的深入研究，会更加清楚MHV 的发病机制和其影响因素，发现更多特异性更强、重复性更好和敏感性更高的检测方法，研究出针对MHV 的特异性预防和治疗药物。■