β-胡萝卜素高效降解菌株的筛选鉴定及产香研究

梁 伟，蔡联合，苏 赞，陈义昌，邹克兴，王明月，王 伊

（1.广西中烟工业有限责任公司，广西南宁 530001；2.河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳 471023）

类胡萝卜素是在分子两端各有1 个不饱和己烯环的四萜化合物，其存在于植物和有光合作用的细菌中，是一类重要的香料前体物质[1]。目前，已知的主要胡萝卜素有α，β和γ共3 种同分异构体，其中β-胡萝卜素占主要地位[2]。β-胡萝卜素被氧化分解产生α-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯和β-大马酮等多种挥发性致香物质[3]。这类致香物质具有较低的感官阈值，是许多香料的特征香味[4]。β-胡萝卜素降解主要有热降解、光氧化降解、化学氧化降解和生物降解[5]。热降解和光氧化降解具有降解条件不够温和的缺点，化学氧化降解则选择性差。尽管利用传统的有机合成或从植物中提取的方法仍具有一定的可行性，但是近年来，通过生物技术制备的天然香料及其酶解-酶促反应生成的天然香料正逐步成为其主要的降解模式，且研究也表明生物降解具有降解效率高、专一性强、催化条件温和、产物中目标化合物含量高等优点，备受学者关注[6]。目前，研究发现酵母菌、芽孢杆菌和巴氏葡萄球菌等微生物能降解β-胡萝卜素[7]。有研究以新鲜水果为样本，筛选出一株降解β-胡萝卜素产生香味物质β-紫罗兰酮的高效菌种。Zorn H 等人[8]筛选的丝状真菌和酵母菌降解β-胡萝卜素产生二氢猕猴桃内酯和β-紫罗兰酮香味物质。蔡程晨[9]从土壤中筛选到一株降解类胡萝卜素的枯草芽孢杆菌，并将其应用于芒果汁发酵，结果显示类胡萝卜素降解产物含量有所增加。田争福等人[10]使用具有类胡萝卜素降解能力的库特氏菌发酵液辅助枸杞酒发酵，发酵结束后其香气成分改善。这些研究也表明，通过生物降解类胡萝卜素改良产品风味特征是可行的。

以学校里常年落叶的土壤为样本，通过形态观察、生理生化和分子生物学鉴定等技术手段，筛选得到β-胡萝卜素高效降解菌株TR-3，旨在为生物降解β-胡萝卜素提供高效降解新菌株。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

土壤，采集自河南科技大学校园内常年落叶的地块；β- 胡萝卜素，北京索莱宝科技有限公司提供；β-胡萝卜素储备液，避光条件下将β-胡萝卜素（10 mg） 溶于二氯甲烷（20 mL） 中，溶解后，加入Tween-80（2 g） 进行乳化，减压浓缩除去二氯甲烷，将残留物分散在蒸馏水（100 mL） 中，微孔滤膜过滤得橘黄色的储备液，置于4 ℃冰箱待用。

1.2 仪器与设备

TSQ9000 三重四极杆GC-MS，赛默飞世尔科技（中国） 有限公司产品；梯度PCR 仪，德国Eppendorf 公司产品；UV-2600 型紫外可见分光光度计，日本岛津公司产品。

1.3 筛选培养基[11]

（1） 富集培养基。蔗糖15 g/L，磷酸氢二钾0.5 g/L，硫酸镁0.5 g/L，硫酸亚铁0.01 g/L，氯化钾0.5 g/L，硝酸钠3 g/L，酵母粉2 g/L。初始pH 值调为7.2~7.4，于121 ℃条件下灭菌20 min。

（2） 分离培养基。富集培养基中加入2%的琼脂20 g/L，β-胡萝卜素储备液20 mg/L。β-胡萝卜素经微孔滤膜过滤除菌，加入冷却至60 ℃的分离培养基中，倒平板，备用。

1.4 试验方法

1.4.1β-胡萝卜素高效降解菌的筛选

取1 g 土样溶于100 mL 无菌水中，振荡12 h，抽滤得菌悬液。用移液枪吸取2 mL 菌悬液加入100 mL富集培养基中，于30 ℃下以转速150 r/min 避光振荡培养12 h。

（1） 初筛。对振荡12 h 的菌液进行梯度稀释，分别选取10-3，10-4，10-5浓度涂布于分离培养基上，设置空白对照，于30 ℃下避光培养24~48 h。观察菌对β-胡萝卜素的分解。

（2） 复筛。选取透明圈明显的单菌落接种于发酵培养基中，于30 ℃下以转速150 r/min 避光培养24 h。β-胡萝卜素降解能力较强的菌株通过测定溶液中β- 胡萝卜素降解率和降解产物进行筛选。

1.4.2β-胡萝卜素标准曲线的绘制

采用紫外可见分光光度计测定β- 胡萝卜素溶液全波长得出，β-胡萝卜素于波长460 nm 处有最大吸收峰，用石油醚分别配制质量浓度为0，2.5，5.0，7.5，10.0 mg/L 的β-胡萝卜素标准溶液，用石油醚作为空白对照，于波长460 nm 处对β-胡萝卜素标准溶液的吸光度进行测量，将其记录为OD460，将OD460作为纵坐标（Y），将β-胡萝卜素质量浓度作为横坐标（X），制作出标准曲线[12]。

1.4.3 菌种生长状态测定

固定培养时间过后，取3 mL 降解菌液，以初始培养基为空白对照，在波长为600 nm 的紫外可见分光光度计中，对菌液的吸光度值进行测定，作为菌种生长状态的判定标准，记为OD600[13]。

1.4.4β-胡萝卜素降解率测定

测得OD600后，发酵液在避光条件下，于4 ℃条件下以转速8 000 r/min 高速离心10 min，留下分离出的沉淀，加入与上清液等体积的石油醚，振荡，使沉淀分散，让沉淀中的β-胡萝卜素完全溶解在石油醚中，静置取上清液，将得到的β-胡萝卜素溶液，用石油醚做空白对照，于波长460 nm 处测定溶液吸光度，根据计算公式计算降解率[14]。

1.4.5β-胡萝卜素降解产物的萃取

（1） 顶空固相微萃取[15]。量取8 mL 避光培养24 h的β-胡萝卜素降解菌液于20 mL 顶空瓶中，加入2 g NaCl 调节离子浓度，添加8 μL 的2 -辛醇作为内标溶液，封口，在40 ℃磁力搅拌器上平衡10 min，插入装有50/30 μm 萃取头的手动进样手柄，吸附萃取40 min 后，收回萃取头纤维部分再取出萃取头，插入GC-MS 进样口于250 ℃下解析5 min，用于GC-MS 分析。

1.4.6β-胡萝卜素降解产物的GC-MS 工作条件

（1） GC 条件。参照参考文献[16]稍作修改，色谱柱为HP-5（30 m×0.32 mm×0.25 μm），载气：高纯度的He，流速1.0 mL/min，进样维持250 ℃，程序升温为起始温度45 ℃，将此温度储存5 min，以5 ℃/min 的速率上升到280 ℃保持20 min，溶剂延迟6 min，进样量1.0 μL，分流比5∶1。

（2） MS 条件。电压70 eV，离子源温度230 ℃，传输线温度280 ℃，检测器温度280 ℃，扫描范围为30~450m/z。

1.4.7β-胡萝卜素高效降解菌的鉴定

（1） 菌落形态观察。包括菌落大小、形状、边缘、光泽、质地、颜色和透明程度等。

（2） 显微形态观察。采用革兰氏染色和显微镜观察。

（3） 16S rDNA 序列分析。

通过16S rDNA 测序对筛选菌株进行分子鉴定。采用细菌基因组DNA 提取试剂盒（BioFlux，Kyoto，Japan） 进行DNA 的提取。以提取的DNA 为模板，进行16S rDNA 扩增。琼脂糖凝胶电泳检测PCR 扩增结果，PCR 产物送生工生物工程（上海） 股份有限公司进行测序。将所测16S rDNA 序列在GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/） 中进行BLAST 比对，选出相似性大于98%的部分序列，以16S rDNA同源性为基础MEGA7 软件构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 β -胡萝卜素标准曲线的绘制

胡萝卜素标准曲线见图1。

图1 胡萝卜素标准曲线

吸光度（Y） 与β-胡萝卜素质量浓度（X） 的回归方程为Y=0.200 32X-0.038，相关系数R2=0.997 1，这表明在0~10 mg/L 的质量浓度范围内，β-胡萝卜素质量浓度与吸光度具有良好的线性关系。

2.2 β -胡萝卜素高效降解菌的筛选

采用富集培养基和分离培养基筛选出具有明显降解透明圈，且在培养过程中有明显香味产生的菌株。

所筛选菌株在类胡萝卜素培养基平板上的菌落形态和降解结果图见图2。

图2 所筛选菌株在类胡萝卜素培养基平板上的菌落形态和降解结果图

2.3 β -胡萝卜素降解率

β-胡萝卜素降解率测定见图3。

图3 β -胡萝卜素降解率测定

对初筛的菌株进行β-胡萝卜素降解率的测定。由图3（a） 可知，含有β-胡萝卜素的培养液接种后，于30 ℃条件下以转速150 r/min 避光培养24 h，培养液的颜色明显变浅且变透亮。对3 株菌的降解能力分析显示，菌株TR-3 对β-胡萝卜素降解能力最强，降解率达到86.65%；菌株TR-2 和TR-1 对β-胡萝卜素的降解能力较弱。故接下来对菌株TR-3进行进一步的研究分析。

2.4 菌种鉴定

2.4.1 形态特征鉴定

菌株TR-3 在添加β-胡萝卜素的固体培养基的菌落呈现出透明，形状较规则，表面光滑且湿润，边缘整齐，容易挑起。革兰氏染色结果为阴性，光学显微镜观察菌体多为短杆状。

菌株TR-3 的革兰氏染色结果（400×） 见图4。

图4 菌株TR-3 的革兰氏染色结果（400×）

2.4.2 生理生化试验

该菌株能利用表1 中的糖产酸产气，且可看到紫色培养基全部变黄，与《常见细菌系统鉴定手册》中关于肠杆菌的描述基本一致，结合形态学鉴定结果，初步鉴定TR-3 为肠杆菌。

表1 菌株TR-3 生理生化试验结果

菌株TR-3 生理生化试验结果见表1。

2.4.3 菌株TR-3 的16S rDNA 分子鉴定

将16S rDNA 测定序列于NCBI Blast 进行同源序列检索，构建系统进化树。菌株TR-3 与Enterobacter sp.strainAPCB2（ON564857.1）、Enterobacter hormaechei subsp.Xiangfangensis strainER48（MT124573.1） 同源性最高。综合形态学观察结果、生理生化试验结果及16S rDNA 分子系统发育分析，鉴定菌株TR-3为肠杆菌属。

TR-3 菌株的16S rDNA 系统进化树见图5。

图5 TR-3 菌株的16S rDNA 系统进化树

2.5 β -胡萝卜素降解产物分析

菌株TR-3 降解β-胡萝卜素产生香气物质，对降解菌液进行顶空固相微萃取后，样品进行GC-MS分析。

香气成分GC-MS 图见图6，色谱峰对应时刻的质谱图见图7。

图6 香气成分GC-MS 图

图7 色谱峰对应时刻的质谱图

该菌株降解β-胡萝卜素后共检出挥发性成分45 种，在这些产物中，仲辛酮相对含量最高（37.69%），其次是苯乙醇（13.88%）、磷酸三丁脂（5.55%）、癸酸乙酯（5.54%）、β-紫罗兰酮（4.8%） 及月桂酸乙酯（3.73%），其他降解产物的相对含量较低，除β-紫罗兰酮和月桂酸乙酯的相对含量在3%以上外，其余降解产物的相对含量均在3%以下。原本预测产物中二氢猕猴桃内酯和β-紫罗兰酮相对含量最高，但实际测得二氢猕猴桃内酯含量仅有0.16%，其原因可能为该菌种降解β-胡萝卜素的反应不同，导致其他产物含量增高。

3 结论

从土壤中分离筛选出一株高效降解β- 胡萝卜素的菌株TR-3，通过形态观察、生理生化和分子生物学鉴定该菌株为肠杆菌属；其对β-胡萝卜素的降解能力较高，降解率达86.65%。菌株TR-3 对β-胡萝卜素的降解产物中共检出挥发性成分45 种，主要包括仲辛酮（37.69%）、苯乙醇（13.88%）、磷酸三丁脂（5.55%）、癸酸乙酯（5.54%）、β-紫罗兰酮（4.80%） 及月桂酸乙酯（3.73%） 等致香物质。试验为β-胡萝卜素的生物降解提供了一株高效降解菌，研究结果对类胡萝卜素生物法制备香精香料提供了理论基础。