钙敏感受体在血吸虫病肝纤维化中的作用

张文娟，李珂云，冯嘉禾，林乐迎，熊 俊，秦静茹，胡 衡，李珍妮，贺 喆，曹镐禄

（1. 赣南医科大学基础医学院；2. 赣南医科大学心脑血管疾病防治教育部重点实验室；3. 赣南医科大学第一临床医学院，江西 赣州 341000）

肝纤维化是一种机体对各种原因引起的慢性肝损伤复杂的修复反应，主要特征是细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）沉积和肝星状细胞（Hepatic stellate cells，HSCs）活化［1］。肝纤维化作为肝脏疾病的过渡阶段，通常被认为是可逆的病理过程［2］。我国是全球肝病负担最重的国家［3］。其中，日本血吸虫感染是引发肝纤维化的常见原因之一。血吸虫病肝脏纤维化是血吸虫感染引起的肝脏特征性病理变化［4］。血吸虫可溶性虫卵抗原不断刺激肝脏，形成虫卵肉芽肿，从而导致严重的肝纤维化［5］。肝纤维化晚期患者出现循环功能障碍，影响患者的生活自理能力，甚至危及患者生命［6］。因此，深入研究血吸虫病肝纤维化的发病机制至关重要。

钙敏感受体（Calcium-sensing receptor，CaSR）是一种在细胞外环境中感知钙离子的受体，主要促进急慢性炎症，触发细胞内多种信号通路［7］。研究表明CaSR参与高糖诱导的心肌细胞纤维化［8-9］。CaSR表达上调与糖尿病并发的肝纤维化相关，即Ca2+的增加可以促进HSC 增殖、纤维化和收缩，最终导致肝纤维化［10］。在血吸虫病肝纤维化中尚未见CaSR作用的报道。本研究建立血吸虫病肝纤维化模型，探究CaSR 在血吸虫病肝纤维化中的作用，为血吸虫病肝纤维化的治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料 BABL/c 小鼠32 只（SPF 级，雌性，6～8 周龄，18～20 g）购于湖北省疾病预防控制中心，饲养于本校实验动物中心；日本血吸虫阳性钉螺购于江苏省南京市血吸虫病防治所。Calhex231购于Sigma 公司；一抗α-SMA、Collagen-Ⅰ、GAPDH购于abcam公司；二抗购于Jackson公司。

1.2 实验方法

1.2.1 血吸虫病肝纤维化模型制作 将小鼠随机分为2组，未感染组和感染组，每组8只。先将血吸虫阳性钉螺置于去氯水中（24～28 ℃，光照12 h）收集尾蚴。感染组小鼠经腹部皮肤感染（20±2）条尾蚴，未感染组小鼠给予生理盐水，20 min后，所有小鼠于实验动物中心饲养8 周。造模结束，麻醉后经颈椎脱臼法处死小鼠，取出肝组织备用。用同样方法构建单纯血吸虫感染组和Calhex231（CaSR 抑制剂）干预的血吸虫感染组小鼠模型（每组8 只）。其中单纯血吸虫感染组感染方式同上，Calhex231干预的血吸虫感染组小鼠于血吸虫感染当天腹腔给予Calhex231（1 mg·kg-1），每日1 次，直至造模结束（即感染后8周）。

1.2.2 HE 和Masson 染色 取肝组织，固定，经酒精梯度（75%、85%、90%、95%和100%）脱水、二甲苯透明后于包埋机中进行石蜡包埋。HE 染色即取蜡块切片（4 μm），经二甲苯脱蜡、梯度酒精（100%、95%、90%、80%和70%）水化后，苏木素染色10 min、伊红染色1 min，封片观察。Masson染色即蜡块切片先脱蜡水化（步骤同HE 染色），再依次经Weigert 氏铁苏木素染色8 min，丽春红染色5 min，蒸馏水漂洗数秒，Masson 复合液染色5 min，磷钼酸分化5 min，苯胺蓝染色5 min后封片观察。

1.2.3 Western-blot 先用RIPA 法裂解0.12 g 肝组织，4 ℃、10 000 g离心15 min 收集上清液，BCA 法测定蛋白浓度。蛋白质（40 g）依次变性（95 ℃）、SDS-PAGE 凝胶电泳（浓缩胶80 V，20 min；分离胶120 V，50 min）、转膜（200 mA，90 min）、室温封闭（5%脱脂奶粉，4 h）、一抗（兔抗鼠α-SMA，Collagen-Ⅰ，1∶1 000）4 ℃孵育过夜、二抗（1∶5 000）室温孵育1 h，ECL显影，采用Image J软件分析条带。

1.2.4 肝组织中ALT/AST 含量测定 根据南京建成ALT/AST检测试剂盒说明书操作［11］。

1.2.5 RT-qPCR Trizol法提取小鼠肝组织RNA。依据mona 试剂盒，将RNA 逆转录为cDNA，并以cDNA 为模板进行CaSR 基因扩增。以GAPDH 为内参，用2-△△CT法分析CaSR mRNA 的相对表达量。CaSR：上游引物5′-GAGCACATCCCTTCAACCAT-3′，下游引物 5′-GCTAGAGGAGGCGTAGCTCA-3′；GAPDH：上游引物5′-TGAAGGGTGGAGCCAAAAG-3′，下游引物5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′。

1.2.6 免疫组织化学 同样取肝组织切片，先经常规方法脱蜡水化，再依次经抗原修复（3% H2O2）15 min，封闭（3%BSA）30 min，一抗（兔抗鼠CaSR，1∶200）4 ℃孵育12 h，二抗（羊抗兔HRP）室温孵育1 h，DAB 染色5 min，苏木精复染细胞核后（染色后均用PBS冲洗3次，5 min/次）封片观察。

1.2.7 天狼星红和VG 染色 取肝组织，经4%多聚甲醛固定。天狼星红染色即取肝脏切片，先经脱蜡水化，再依次经铁-苏木精染液染色15 min，自来水漂洗10 min，天狼星红染液染色20 min，5%冰醋酸漂洗3 min 后封片观察。VG染色即经相同方法脱蜡水化肝脏切片，先经铁-苏木精染液染色15 min，自来水冲洗10 min，再经VG 染液染色5 min，95%酒精快速分化数秒后封片观察。

1.3 统计学处理 数据使用SPSS 19.0或GraphPad Prism 9.0软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 小鼠肝组织病理学变化 HE 染色结果显示，未感染组小鼠肝细胞排列整齐、完整，未见明显变性、坏死和炎性细胞浸润，而感染组小鼠肝组织中出现大量虫卵且虫卵周围有胶原纤维沉积，形成虫卵肉芽肿，肉芽肿周围可见大量炎性细胞浸润且有局部坏死。Masson 染色结果显示，未感染组小鼠肝细胞排列整齐，肝小叶结构完整，且肝组织未见明显胶原沉积，感染组小鼠肝组织大量破坏，出现大量假小叶且周围有大量胶原纤维化增生（图1）。

图1 小鼠肝组织病理学变化

2.2 小鼠肝组织α-SMA 和Collagen-Ⅰ蛋白表达比较 Western blot 结果显示，与未感染组相比，感染组小鼠肝组织α-SMA 和Collagen-Ⅰ蛋白表达增加，差异有统计学意义（P＜0.01）（图2）。

图2 小鼠肝组织α-SMA和Collagen-Ⅰ蛋白表达

2.3 小鼠ALT、AST含量比较 与未感染组相比，感染组小鼠肝组织中ALT 和AST 含量明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）（图3）。

图3 小鼠ALT、AST含量比较

2.4 小鼠肝组织CaSR表达比较 RT-qPCR和免疫组织化学检测小鼠肝组织中CaSR 的表达，结果显示，与未感染组比较，感染组小鼠肝组织中CaSR的表达明显增加，差异有统计学意义（P＜0.01）（图4）。

图4 小鼠肝组织CaSR表达比较

2.5 CaSR 抑制剂对小鼠肝纤维化的影响 天狼星红染色将胶原纤维染成红色。天狼星红染色结果显示，感染组小鼠肝组织结构已严重破坏，且出现大量胶原纤维沉积；CaSR抑制剂干预组小鼠肝组织结构出现破坏，但尚有部分组织为完整结构。VG染色将胶原纤维染成粉红色。VG 染色结果显示，感染组小鼠肝组织已呈现出大量粉红色，而CaSR抑制剂干预组小鼠肝组织呈现出部分粉红色，尚有部分完整组织结构。提示Calhex231 可减轻血吸虫病小鼠的肝纤维化（图5）。

图5 CaSR抑制剂对小鼠肝纤维化的影响

3 讨论

肝纤维化形成的核心是HSCs 的活化［12］。HSCs受到刺激，产生ECM。ECM 过度沉积，形成肝脏纤维化［13］。与酒精性肝病、非酒精性肝病和病毒性肝病相比较，血吸虫病肝纤维化的发病机制不同［14］。血吸虫病肝纤维化存在HSCs 的活化过程，但并不破坏肝细胞，是以虫卵为中心形成慢性肝脏肉芽肿的过程［15］。

α-SMA为HSCs活化的指标，Collagen-Ⅰ是ECM沉积的主要胶原蛋白，ALT 和AST 为肝脏损伤的指标［16-17］。本研究发现，血吸虫病肝纤维化中小鼠的α-SMA 和Collagen-Ⅰ表达增加，且ALT/AST 含量增加，提示血吸虫病肝纤维化小鼠肝功能破坏严重，与QI X 等［18］报道相一致。且在糖尿病并发大鼠纤维化的肝组织及细胞中α-SMA 和Collagen-Ⅰ表达升高，ALT、AST 含量也显著升高［10］。CaSR 作为Ca2+受体，参与急慢性炎症［19］。本研究发现，小鼠肝组织中CaSR表达升高，且CaSR抑制剂Calhex231可减轻血吸虫病肝纤维化。在糖尿病并发的大鼠纤维化模型［10］及急性心肌梗死大鼠模型［20］中也有相似报道。然而LEE P C 等［21］研究发现，与非肝硬化患者相比，肝硬化患者CaSR 表达降低，可能是CaSR在不同疾病中有相反作用。而血吸虫病患者中CaSR 的表达情况有待于后续验证。YUAN H 等［22］发现，CaSR促进心肌纤维化细胞分泌TGF-β1，TGF-β1作为促纤维化因子，通过结合心肌纤维化细胞表面的TGF-βRⅡ，活化胞内段的丝氨酸/苏氨酸激酶，进一步活化TGF-βRⅠ；TGF-βRⅠ活化后，通过丝氨酸/苏氨酸激酶，依次使Smad2、Smad3磷酸化。磷酸化的Smad2、Smad3 与Smad4 结合，形成三聚体，一起转移至细胞核内，与转录因子结合，启动纤维化转录。CaSR 在血吸虫病肝纤维化中的作用机制尚需采用CaSR缺陷型血吸虫病小鼠模型进行探究。

综上所述，CaSR可能参与小鼠血吸虫病肝纤维化进程，CaSR有望成为血吸虫病肝纤维化的潜在治疗靶点，该靶点的发现为血吸虫病肝纤维化的治疗提供新的实验依据。