反复呼吸道感染患儿外周血单个核细胞中TLR2、TLR4表达情况与Th1/Th2免疫应答的关系*

赵淑景,马志平,张金彪,付 峰,冯娜娜

沧州中西医结合医院:1.儿科一区;2.实验诊断科;3.科教科,河北沧州 061000

反复呼吸道感染(RRTI)是儿科常见的呼吸系统疾病。RRTI患儿1年内发生呼吸道感染的次数不在正常范围内,包括上呼吸道和下呼吸道感染,而且两次感染间隔时间7 d以上。该病病因并不完全清楚,主要与先天性因素、免疫功能低下及微量元素和维生素缺乏等有关[1]。目前最明确的病因之一是机体免疫功能异常。因幼儿免疫系统尚在发育阶段,再加上呼吸系统解剖结构的特点,RRTI的疾病好发群体为年龄低于2岁的儿童[2]。如果RRTI患儿没有得到及时的治疗或正确的干预,就有可能会并发心肌炎、哮喘等疾病,从而对身心健康和生长发育产生不利影响[3]。RRTI的发生与机体免疫功能关系十分密切。辅助性T细胞(Th)在免疫系统中起着关键作用,而Th的亚型Th1/Th2细胞因子水平可以反映出机体的免疫应答是否处于平衡状态,与机体的炎症反应、抗肿瘤效应等病理反应有关[4]。Toll样受体(TLRs)蛋白家族都属于Ⅰ型跨膜蛋白,它可以通过对病原微生物的保守抗原分子进行识别,从而对细胞内的信号传导通路进行激活,最终产生一系列炎症细胞因子,如白细胞介素-4(IL-4)、干扰素-γ(IFN-γ)等,并激活机体产生免疫细胞应答,它是连接特异性免疫和非特异性免疫的桥梁[5]。有研究发现,TLRs具有不同的表型及相应配体,可使Th细胞朝不同方向分化,并能够识别相关的细胞表面受体和参与Th型免疫应答的调控[6]。目前,关于RRTI患儿外周血单个核细胞(PBMC)TLRs表达与Th免疫应答关系的研究报道较少。因此,本研究拟通过对RRTI患儿PBMC中TLR2、TLR4的表达进行检测及与对照组进行比较,旨在探讨其与Th1/Th2免疫应答的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 将2020年12月至2022年12月本院收治的65例确诊为RRTI的患儿纳入研究作为RRTI组。纳入标准:(1)符合《反复呼吸道感染的临床概念和处理原则》中儿童RRTI的临床诊断标准[7];(2)年龄2～6岁;(3)临床资料完整;(4)病程1年以上。排除标准:(1)3个月内接触过射线;(2)合并血液类疾病、先天性疾病或家族有遗传性疾病史;(3)3个月内使用过影响免疫功能的药物或激素类药物;(4)有严重心、肝、肾等重要器官功能障碍;(5)在此研究前参加过其他研究;(6)在研究中途主动退出。另选取同期体检的健康儿童45例作为对照组。RRTI组中,男31例、女34例,年龄2～6岁、平均(4.57±1.24)岁;对照组中,男20、女25例,年龄2～6岁、平均(5.04±1.04)岁。两组儿童性别、年龄等一般资料比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。纳入研究患儿的监护人均对本研究知情同意并签署知情同意书。本研究经本院医学伦理委员会审批通过。

1.2方法

1.2.1血液标本采集及处理 RRTI组于入院后次日(对照组于体检当日)清晨接受3 mL空腹静脉血采集。将血液标本置于无菌肝素抗凝管中,采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法,得到PBMC。

1.2.2指标检测 (1)实时荧光定量PCR(qPCR)检测PBMC TLR2和TLR4信使核糖核酸(mRNA)相对表达水平。在得到PBMC后,用异硫氰酸胍(Trizol)法提取细胞总核糖核酸(RNA),反转录成互补脱氧核糖核酸(cDNA)后进行qPCR检测。(2)流式细胞仪检测PBMC TLR2和TLR4蛋白表达率。将PBMC分装在不同的反应管中,分别孵育对应抗体,其阴性对照为PE标记的免疫球蛋白G(IgG),室温避光染色0.5 h,加入溶血素,混匀后静置1 min,离心15 min,磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤2次,最后上机检测儿童PBMC TLR2和TLR4蛋白表达率。(3)酶联免疫吸附法(ELISA)检测血浆中Th1细胞因子IFN-γ、Th2细胞因子IL-4水平及二者比值(IFN-γ/IL-4)。检测使用IFN-γ、IL-4 ELISA试剂盒,操作步骤参考试剂盒说明书。

2 结 果

2.1两组儿童血浆IFN-γ、IL-4水平及IFN-γ/IL-4比较 RRTI组血浆Th2细胞因子IL-4水平高于对照组,血浆Th1细胞因子IFN-γ水平低于对照组,IFN-γ/IL-4低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 两组儿童血浆IFN-γ、IL-4水平及IFN-γ/IL-4比较

2.2两组儿童PBMC中TLR2和TLR4 mRNA及蛋白表达情况 RRTI组PBMC中TLR2和TLR4 mRNA相对表达水平及蛋白表达率均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 两组儿童PBMC中TLR2和TLR4 mRNA及蛋白表达情况比较

2.3PBMC中TLR2、TLR4的蛋白表达率与血浆IFN-γ、IL-4水平的相关性分析 RRTI患儿PBMC中TLR2和TLR4的蛋白表达率与血浆IFN-γ水平、IFN-γ/IL-4均呈负相关(P<0.05),而与血浆IL-4水平均呈正相关(P<0.05)。见表3。

表3 TLR2、TLR4的蛋白表达率与IFN-γ、IL-4的相关性分析

3 讨 论

RRTI是指1年内上呼吸道或下呼吸道感染次数频繁,超过了一定范围的呼吸道感染。不同的年龄RRTI诊断标准不同。反复上呼吸道感染,≤2岁婴幼儿超过7次/年,3～5岁儿童为超过6次/年,≥6岁儿童为超过5次/年或反复下呼吸道感染,≤2岁婴幼儿超过3次/年,3～5岁儿童超过2次/年,≥6岁儿童超过2次/年可诊断为RRTI[8]。RRTI的临床表现有鼻塞、咳嗽等,还常常伴随面色不佳、盗汗及呼吸困难等症状[9]。流行病学调查显示,我国儿童RRIT的发病率为20%左右[10],而且发病率呈逐年增加的趋势,已经成为了低龄儿童死亡的最重要原因之一。免疫、营养、感染及环境等都是导致RRTI发生的原因,其中免疫因素与RRTI有着密切的联系[11]。如果不能得到及时的治疗,患儿身心健康和生命安全会受到极大的损害。

IFN-γ属于Th1的代表性细胞因子,能够促进T淋巴细胞的分化和成熟,引起巨噬细胞和单核细胞表面抗原表达,进而参与抗原递呈和特异性免疫识别过程[12]。IL-4属于Th2的代表性细胞因子,可以刺激B细胞分泌IgE,抑制IFN-γ产生,引发肥大细胞脱颗粒,最后导致多种炎症介质释放[13]。此外,Th1细胞因子IFN-γ对Th2细胞因子IL-4具有拮抗作用,能诱发IgE分泌,减少过敏反应。因此,本研究分析了RRTI患儿血浆中Th1的代表性细胞因子和Th2的代表性细胞因子的水平。结果显示,RRTI组血浆Th2的代表性细胞因子IL-4的水平明显高于对照组,血浆Th1的代表性细胞因子IFN-γ的水平明显低于对照组,IFN-γ/IL-4明显低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。这表明RRTI的发生、发展可能与患儿体内Th1/Th2免疫应答失衡有关。Th1的主要细胞因子IFN-γ表达受到抑制,Th2的主要细胞因子IL-4过度活化。

TLRs不仅表达于免疫细胞的表面,如树突状细胞等,同时还在非免疫细胞表面表达,如成纤维细胞等[14]。TLRs与机体炎症和免疫反应过程均有着紧密的联系,而TLRs异常表达会导致炎症和免疫反应失衡,进而诱发自身免疫性疾病[15]。人体中发挥重要作用的TLRs分子包括TLR2和TLR4分子。本研究利用qPCR和流式细胞术两种方法对RRTI患儿PBMC中TLRs分子的表达情况进行了检测。研究结果显示,RRTI组PBMC中TLR2和TLR4 mRNA相对表达水平及蛋白表达率均明显高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。这表明TLRs可以参与Th1/Th2免疫应答平衡的调节,与李天萍等[16]的研究结果基本一致。本研究还发现,RRTI患儿PBMC中TLR2和TLR4蛋白表达率与血浆IFN-γ和IFN-γ/IL-4均呈负相关(P<0.05),而与IL-4均呈正相关(P<0.05)。这提示TLR2和TLR4可能通过TLR信号通路及配体参与Th1/Th2分化的调控,使Th2过度活化,从而大量释放IL-4,减少IFN-γ的产生,最终引起Th1/Th2失衡,导致RRTI的发生。

综上所述,RRTI患儿PBMC中TLR2、TLR4及血浆中的Th1/Th2细胞因子均可能参与疾病的发生、发展过程。RRTI患儿PBMC中TLR2和TLR4蛋白表达率的升高,可能会使Th1功能受损,Th2功能增强,导致Th1/Th2免疫应答失衡。